1、ICS 65120B 46 a亘中华人民共和国国家标准GBT 21 1082007_I- j同饲料中氯霉素的测定效液相色谱串联质谱法Determination of choramphenicol in feedsHigh performance liquid chromatography tandem mass spectometry2007-10-24发布 2008-04-0 1实施丰瞀徽鬻瓣訾矬赞星发布中国国家标准化管理委员会及111刖 置GBT 211082007本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位
2、：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准主要起草人：赵根龙、高生、宋荣、张发旺。本标准首次发布。饲料中氯霉素的测定高效液相色谱串联质谱法GBT 2110820071范围本标准规定了测定饲料中氯霉素的高效液相色谱串联质谱法(LCMSMS)。本标准适用于配合饲料和预混合饲料中氯霉素的测定，其最低定量限为10 pgkg，最低检测浓度为5 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件
3、的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样(GBT 1469913原理饲料中的氯霉素用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮气吹干。残渣溶于甲醇氯化钠溶液，用正己烷萃取除去脂溶性杂质。再将氯霉素回提至乙酸乙酯，吹干。用乙腈水溶液溶解，过cls小柱净化。最后用LCMSMS法分离、检测和定量。4试剂与材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为蒸馏水，色谱用水符合GBT 6682的一级用水的规定。41乙腈：色谱纯。42甲醇：色谱纯。43乙酸乙酯。44正己烷。45三氯甲烷。46乙腈溶液461乙腈溶液I：取50mL乙腈加水9
4、5mL。462乙腈溶液：吸取乙腈50 mL加水50 mL。47氯化钠。48氯化钠溶液：浓度为40 gL，称取400 g氯化钠(47)加水溶解定容到1 000 mL。49氯化钠甲醇溶液：取200 mL甲醇(42)加氯化钠溶液(48)800 mL。410氯霉素标准品：纯度大于98。411氯霉素标准液4111标准贮备液：准确称取100mg+O1mg氯霉素标准品(410)用乙腈溶解，定容到100mL，该溶液氯霉素浓度为1 mgmL，密封贮于冰箱内，有效期为一年。4”2标准中间液I：吸取标准贮备液(4111)500mL，于50mL容量瓶内，用乙腈溶液(462)定容至50 mL，该溶液氯霉素浓度为100
5、btgmL，密封贮于冰箱内，有效期3个月。】GBT 2110820074，113标准中间液：吸取标准中间渡I(4，112)100 mL于100 mL容量瓶内，用乙腈溶液(462)定容至100 mL，该溶液氯霉素浓度为10 tagmL，密封贮于冰箱内，有效期为3个月。4114标准中间液：吸取标准中间液(4113)1000 mL于100 mL容量瓶内，用乙腈溶液(462)定容至100 mL。该溶液氯霉素浓度为100 ngmL，密封贮于冰箱内，有效期为7天。4115标准工作溶液：用移液管分别吸取标准中间液(4，114)1、5、10、50 mL于4个100 mL容量瓶内，用乙腈溶液(462)定容至刻度
6、。该溶液氯霉素浓度为10、50、10、50 ngmL。412 C，s固相萃取(SPE)d、柱：载体200 mg、承载液体体积3 mL。5仪器51离心机：转速为4 000 rmin以上。52超声波提取器。53涡旋混合器。54密封盖塑料离心管：50 mL。55液相色谱串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)的渡相色谱串联质谱仪。6试样的制备按GBT 146991选取有代表性的实验室样品，用四分法缩分至约200 g，粉碎过0，45 mm孔径筛，混合均匀，装入磨口瓶中备用。7分析步骤71提取称取一定量的试样(配合饲料5 g，预混合饲料1 g，精确至0001 g)，置于50 mL塑料离心管内(54)加40
7、0 mL乙酸乙酯(43)盖好密封盖于涡旋混合器上混合2 min。放入超声波提取器中提取20 min，其间用手摇动两次。将离心管取出，置离心机上(51)4 000 rmin离心分离4 min。用移液管取上清液20 mL，于50加热器上用氮气吹至近干，待净化。72净化721液一液分配净化用氯化钠甲醇溶液(49)2、1、1 mL分三次溶解残渣(7，1)，均转移到同一个10 mL具塞试管内。加4mL正己烷，涡旋混合2min，放人离心机于4 000 rmin离心4min，弃去上层正己烷，重复上述操作一次。水相加乙酸乙酯(43)3 mL，涡旋混合2 rain，放入离心机4 000 rrain离心4 rai
8、n。吸取上层乙酸乙酯，水相置另一个5 raL具塞试管内，加乙酸乙酯(43)2 mL重复上述操作一次。吸取上层乙酸乙酯，置于上述同一个水相具塞试管内，置加热器上50C下，用氮气吹干。用3 mL乙腈溶液I(461)溶解，待SPE小柱净化。722 SPE柱净化每一试样各准备一支c，。小柱(412)，顺序用5mL甲醇，5mL三氯甲烷，5mL甲醇和10mL水预清洗c，s柱。将样液(721)过此小柱(流速1 mLmin)，用5 mL乙腈溶液I(461)淋洗，最后用3 mL乙腈溶液(462)洗脱，收集洗脱液于10 mL具塞试管内。洗脱液加5 mL乙酸乙酯涡旋混合1 min，2 000 rrain离心，下层水
9、相用乙酸乙酯重复萃取一次，合并乙酸乙酯提取液于5 mL具塞试管内。在加热器上(50C)用氮气吹于，用2 mL乙腈溶液(4，62)溶解，调节试样溶液浓度，使上机浓度不高于100 ngmL。73测定731液相色谱条件色谱柱：Cls柱，柱长150mm，柱内径21mrD，粒度35zm或性能类似的分析柱。2柱温：室温。流动相组成：乙腈+水一30+70(V。+Vz)。流动相流速：250,uLmin。进样量：10 tLL。732质谱条件电喷雾离子源(ESI)负离子方式检测。喷雾电压：3 500 V。壳气流速：068 Lrain。辅助气流速：36 Lrain。毛细管温度：300。母离子321，二级子离子为25
10、7、152、121。碰撞电压如表1表1 氯霉素的子离子及其碰撞电压GBT 211082007母离子 子离子 碰撞压力eV321 257 23321 152 1832l 121 12733试样的测定在上述仪器条件下，分别注入标准工作液(4115)和试样溶液(722)10 ILL，以保留时间和二级子离子(mz)257、152、121进行定性，其相对丰度比见表2。以152作为定量子离子，并用氯霉素标准工作液做单点或多点校准，以峰面积比较进行定量计算。表2氯霉素的子离子及相对丰度比子离子(。) 257 152 12l相对丰度 100 90士18 8士48结果计算与表述81结果计算试样中氯霉素的含量x，
11、以质量分数微克每千克(Fgkg)表示，单点校准时可用式(1)计算：v P2V1cnP1mXn式中：P：试样溶液对应的色谱峰面积响应值；y。加入定容液的体积，单位为毫升(mL)；c氯霉素标准溶液的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；U氯霉素标准溶液的进样体积，单位为微升(pL)；n稀释倍数；P，氯霉素标准溶液对应的色谱峰面积响应值；m试样质量，单位为克(g)；U试样溶液的进样体积，单位为微升(pL)。多点校准时可用式(2)计算：x一!丕生丕!丕! )123(GBT 211082007式中：vl加入定容液的体积，单位为毫升(mL)；“标准曲线上查得的试样中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)
12、V。氯霉素标准溶液的进样体积，单位为微升(pL)；n稀释倍数；m试样质量，单位为克(g)；v。试样溶液的进样体积，单位为微升(p-L)。82结果表示结果以平行测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。9重复性在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10。4附录A(资料性附录)氯霉素一级质谱圈GBT 2110820072目 95241 9931787 35788 383i 89 423 31 478827918J I j1If8ili lII|14ff：?：I 7f i4i【1川l|Ij 。jI 川|I【|I|mz图A1氯霉素一级质谱图GBT 211082007附录B(资料性附录)氯霉素特征离子色谱图RT：415AA：18660RT：4 18AA：16572AA：1394注：RT为保留时间，单位为分钟(min)；AA为峰面积。图B1 氯霉素特征离子色谱图蚰o帅o舯帅o舯舯仰加0
