1、GB ICS 65.150 B 51 中华人民共和国国家标准GB/T 25166-2010 +采常用裙2011-05-01实施Wakame 2010-09-26发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会吉立E马防伪/ 中华人民共和国国家标准裙带菜GB/T 25166-2010 峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销当&开本880X12301/16 印张O.5 字数9千字2010年11月第一版2010年11月第一次印刷唔书号:155066 1-
2、40628 定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目。吕本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。本标准主要起草人z王飞久、孙修涛、胡自民、汪文俊、王翔宇、李修良。GB/T 25166-2010 I GB/T 25166-2010 裙#市菜范围本标准规定了裙带菜Undariapinnatifida CHarvey) SuringarJ主要形态构造特征、生活周期与繁殖、遗传学特征以及检测方法。本标准适用于裙带菜
3、的种质检测和鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY /T 5283-2004元公害食品裙带菜养殖技术规范3 名称与分类3. 1 种名裙带菜Undariainnat听daCHarv. )SuringarJ。3.2 分类褐藻门CPhaeophyta)、褐子纲CPhaeosporeae)、海带目CLaminariales)、翅藻科CAlariaceae)、裙带菜
4、属CUndaria)。4 主要形态构造特征4.1 外部形态特征4. 1. 1 抱子体形态藻体明显分为国着器、柄和叶片三部分。裙带菜抱子体外部形态见图105 3 1一-固着器;2一一柄;3一一叶片;4 袍子叶F5一一中肋。圄1裙带菜于包子体的外部形态1 G/T 25166一-20104. 1.2 固着器由多次双分枝的圆柱形假根组成，其末端有吸盘。4.1.3柄扁平，其腹背隆起而稍圆，柄的边缘有狭窄的龙骨。藻体接近成熟时，在柄的两侧形成耳状抱子叶，抱子叶定义见NY/T5283一2004中的3.3。4.1.4 叶片褐色具光泽。幼时长盾形，边缘光滑无缺刻，为单叶。成藻为羽状裂片，叶片的中部是由柄部延伸而
5、来的中肋，中肋扁平隆起直达叶片的顶端。成藻一般长1.0 m2. 5 m，宽50cm100 cm。4.2 抱子体内部构造特征4.2.1 表皮由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状。细胞含粒状色素体。4.2.2 皮层外皮层细胞呈柱状，大小不等，排列不整齐。内皮层细胞大小相近，排列较整齐。4.2.3 髓部细胞呈丝状或树枝状，排列疏松。5 生活周期与繁殖5.1 生活史明显的抱子体(切，大型)与配子体(，微型)不等世代交替型。5.2 生命周期裙带菜的生命周期为一年。5.3 繁殖5.3. 1 性成熟年龄8个月12个月。5.3.2 无性繁殖抱子体柄部产生抱子叶，抱子叶上产生抱子囊群，抱子囊内形成游
6、抱子。游抱子单细胞，梨形，长9ml1m，宽5m6m，有两条侧生不等长鞭毛，长的14.0m16. 5m，伸向前端，短的5.3m7.0m，伸向后端。5.3.3 有性繁殖卵配方式。雄配子体产生精子囊，每个精子囊产生一个梨形精子，精子(n)长4m5mo雌配子体产生卵囊，每个卵囊产生一个卵(川，卵成熟后排出体外粘着在卵囊口处与精子结合生成合子(2n)。6 遗传学特征6. 1 染色体数抱子体细胞染色体数2n=60o6.2 DNA序列特征6.2.1 ITS-1序列:总长度242bp。1 ccgatcagga aggggacacc ctcctgacac taccgtcgtg cgcgtcggtt ttgtaa
7、accc cgagaaagaa 71 aatcgttacg cgatgttggg cgaggggcgc ctcgccgagg gttaattccc tcgaatcaaa gcgcacccca 141 cttttcaacc ccattaaact ctgaatctga actcaaaagg ggggcatgcg cgcgcccgcg cgcgcggctc 211 ccccaacctt taacgttgta aaactttcag cg 6.2.2 ITS-2序列:总长度273bpo 2 GB/T 25166-2010 1 cccctccctc cccctctctt tgtggggggg gggggg
8、gttt cggggcggac tatgagtgtt ccggagcgtc 71 cgcgctccga gtgcacccaa tctcgtgaac gaagcctctc gcgccctgcc gcacagagtt gttgacggcg 141 ctcgcttcgg cggcgactct cgactcacca aacgtgcgcg gggattcgcc tgcttcattc cggctcatgc 211 cttttccccc cccccgcccc cacgcaagtg agggagggag ggaaggagag gccatatcca cac 6.2.3 裙带菜不同品系核糖体ITS全序列(ITS-
9、l+ ITS-2)变化幅度为010个碱基。7 检测方法7. 1 形态构造特征检验采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。7.2 染色体检验7.2. 1 标本的制备压片法。7.2.2 染色液2%地衣红溶于70%的乙酸中。7.2.3 染色方法固定材料在自来水中浸泡15min30 min后压片。揭开盖片，滴入乙酸地衣红后盖片0.5h，用滤纸吸出多余的染色液，石蜡封片。7.3 裙带菜ITS序列的检测7.3.1 裙带菜配子体基因组DNA的提取取约1g(湿重)的裙带菜配子体，加少量石英沙和PVP-40，在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL 的离心管中，加人15mL裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,
10、 10 mmol/L EDTA, 1. 0 mol/L NaCl , 1. 0% CTAB, l% SDS, pH=8. 0)，在65.C保温1h，期间摇匀几次。用等体积的酣=三氯甲:皖=异戊醇(25: 24 : 1，体积比)抽提两次，再将水相转移至一新的50mL离心管中，加入1/10体积RNA酶，37 .C保温1h，再用三氯甲皖=异戊醇(24: 1，体积比)抽提一次，用2/3体积的异丙醇沉淀回收DNA。DNA最后溶于100L的TE(10mmol/L Tris-HCl,pH=8. 0;1 mmol/L EDTA, pH=8. 0)中。7.3.2 ITS特异性扩增总反应体积为20L，含10mmo
11、l/L Tris-HCl, pH = 8. 3 , 50 mmol/L KCl , 1. 5 mmol/L MgClz, Taq polymerase 1 U ，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4mmol/L6 mmol/L(正向引物P1:5人CGCGAGTCATCAGCTCGCATT吐气反向引物P2:5 -AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3勺，模板DNA 10 吨，其余用双蒸馆水补满。PCR反应参数:96 .C预变性5min;96 .C , 30 s;72 .C , 60 s;55 .C , 30 s，37个循环;72 .C，保温5 min。7.3.3 测序参照DNA测序仪
12、进行测序(参见附录A)。8 判定规则被检样品完整并符合本标准第4章要求的为合格样品。如被检样品不完整需增加第5章、第6章内容进行检验，均符合上述质量要求的为合格样品。OFON|户的NH阁。GB/T 25166-2010 附录(资料性附录)DNA序列的测序A PCR扩增完毕，将样品置于20 .C条件下。利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。具体操作如下:往PCR产物中加入4倍体积75%异丙醇，室温沉淀30min。在3200 r/min下离心30min; 去掉上清，加8倍体积75%异丙醇。室温静置10min; 在3200 r/min下离心10min，去上清;在50.C烘干3min以除去残留的异丙醇，或
13、置于温箱中盖上保鲜膜至元异丙薛;加入适量的元菌去离子水稀释，1000r/min振荡?昆匀。测序样品预处理A.1 a) 、，/hu c) d) e) A. 2.1 行测序。注:本标准以ABIPRISM 3730测序仪为例，不排除采用具有同等工效的其他型号的测序仪。A.2.2 设立双脱氧测序反应。要求:a) 引物:测序引物即为扩增引物;b) 微量滴定板:为96孔U形微量滴定板;链延伸链终止反应混合液的配制。测序凝肢的制备。准备样品和列表，上样到微量滴定板中进行测序。电压160V/cm，温度42.C。根据凝胶的荧光放射自显影，运用计算机读取DNA序列。测序A.2 纯化后的PCR产物在ABIPRISM 3730测序仪上采用Sanger双脱氧链终止法原理从两端进c) A.2.3 A.2.4 A.2.5 A.2.6 数据处理利用相关的生物信息学软件读取所测裙带菜ITS序列，并同GenBank中公开的近缘种序列进行比对，确定裙带菜ITS(包括ITS-1，5.8S和ITS-2)序列的起点和终点。利用软件MEGA计算裙带菜不同品系ITS序列的变异数目。A.3 侵权必究等书号:155066，1-40628 定价:版权专有14.00元GB/T 25166-2010 打印日期:2010年12月3日F002
