1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1933. 1-2007 食品和水中肠球菌检验方法第1部分:平板计数法和最近似值测定法2007-05-23发布Detection of Enterococci in food and water一Part 1 :岛lethodfor plate count and岛lPN2007-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目。吕SJ/T 1933(食品和水中肠球菌检验方法分为两个部分:第1部分:平板计数法和最近似值测定法;第2部分:滤膜法。本部分为SN/丁1933的第1部分。本部分的附录B为规范性附录，附录A是资料性附录。本部分由国家
2、认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局负责起草。本部分主要起草人:郑秋月、曹际娟、于灵、赵昕、王金玲、徐杨。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1933.1-2007 SN/T 1933.1-2007 食品和水中肠球菌检验方法第1部分:平板计数法和最近似值测定法1 范围S:-.J /T 1933的本部分规定了食品和水中肠球菌平板计数、最近似值测定的检验方法。本部分适用于生活用水、生产加工用水及食品中肠球菌的检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过S:-.J/T1933的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修
3、改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法S:-.J /T 0330 出口食品中微生物学检验通则3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语、定义和缩略语适用于SN/T1933的本部分。肠球菌Enterococci 一类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽胞和英膜，可分解胆汁七叶音。是评估食品、水、食品加工设备、食品生产环境等卫生状况的指标菌之一。3.2 略缩语3.2.1 BEA 胆汁七叶昔琼脂。3.2.2 BHIB 脑心浸液
4、肉汤。3.2.3 BHIA 脑心浸液琼脂。4 设备和材料4.1 电子天平:感量为0.001go 4.2 恒温水浴箱:46C士1C。4.3 恒温培养箱:35C士O.5C ，36C士lC，45C士O.5C ，35C士2C0 4.4 均质器。4.5 振蔼器。4.6 移液管:容量1mL, 10 mL。4. 7 培养皿。5 培养基和试剂实验用水符合GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法的要求。除另有规定外，试剂为分析纯。5.1 叠氮化铀葡萄糖肉汤(见附录第A.1章)。5.2 肠球菌肉汤(见附录第A.2章)。SN/T 1933.1-2007 5.3 KF链球菌琼脂(见附录第A.3章)。5.4 肠球菌
5、琼脂(胆汁七叶昔叠氮铀琼脂)(见附录第A.4章)。5.5 胆汁七叶昔琼脂(BEA琼脂)(见附录第A.5章)。5.6 脑心浸液肉汤(见附录第A.6章)。5. 7 含6.5%氧化铀()JaCl)脑心浸液肉汤(见附录第A.7章)。5.8 脑，心浸液琼脂(见附录第A.8章)。5.9 缓冲蛋白陈水(见附录第.9章)。6 样品制备6.1 抽样数量及抽样方法抽样数量及抽样方法按SN/T0330进行。6.2 样品的贮存和运送采样后应尽快进行检验，冷冻样品如不能立即进行检验，应置于一180C保存。应冷藏保存的待检样品在运送实验室过程中应于lOC40C保存。样品采集后8h之内要完成检验。6.3 制样6.3. 1
6、水及液体饮料:污染程度低的水及液体饮料可以直接进行检验;污染程度严重的水及液体饮料吸取25mL样品，加入225mL缓冲蛋白脏水中，充分泪匀，制成1: 10样品匀液。6.3.2 固体或半固体食品:无菌操作取25g样品放入装有225mL缓冲蛋白陈水的均质杯内，以8 000 r/min均质1min2 mi口，制成1: 10样品匀液。6.3.3 以上样品制备可根据样品污染程度及检验需要，进一步制成10倍递增的样品稀释液。7 检验程序食品和水中肠球菌平板计数法检验程序见图102 25旦(mL)十225mL缓冲蛋白j陈水10倍梯度稀释选择2个3个适宜连续稀释度，各取1mL分别加入灭菌培养皿或图1食品和水中
7、肠球菌平板计数法的检验程序示意图SN/T 1933.1-2007 食品和水中肠球菌最近似值(MPN)测定法检验程序见图2025旦(mL)+225 mL缓冲蛋白陈水选择3个适宜连续稀释度，各取1mL分别加入肉汤中或MPN值法报告肠球菌数/g(mL)肠球菌肉汤管35(土2C21 h土2h 叠氮化纳葡销糖肉汤管3T(士1C, 24 h 48 h 甲图2食品和水中肠球菌最近似值(MPN)法的检验程序示意图8 检验步骤与计数8.1 平板计数法8.1. 1 适用范围此方法适用于检验未经加工处理的生鲜食品及肠球菌菌数大于10CFU/g(mL)的水和食品。8.1.2 培养基制备制备KF琼脂培养基或肠球菌琼脂(
8、胆?十七叶昔叠氮铀琼脂)(参见第A.3章或第A.4章)，倾注平板前将融化的培养基于46C士lOC水浴保温。8.1.3 接种和培养8.1.3. 1 根据样品污染情况，选择2个3个适宜连续稀释度的样液，分别吸取1mL稀释液，加入培养皿中，每个稀释度做两个平板。8.1.3.2 稀释液加入培养皿后，把保持460C士1c的KF琼脂或肠球菌琼脂15mL倾入培养皿内，使样液与培养基充分泪合。水平放置，使琼脂凝固。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个培养皿所用时间不应超过20mino倒置平板进行培养，KF平板置360C士10C培养48h士2h;肠球菌琼脂平板置350C士20C培养24h士2ho 8.1.
9、4 菌落形态观察肠球菌属细菌在KF平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐;在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环3 SN/T 1933.1-2007 的棕黑色菌落。用灭菌接种针从每个KF平板或肠球菌琼脂平板挑取10个典型菌落，进一步做确证实验。8.1.5 确证实验典型菌落分别接种到BHIB肉汤和BHIA斜面，BHIB肉汤置350C士0.50C培养24h士2h, BHIA 斜面置350C士0.50C培养48h :l: 2 ho 8.1.5.1 BHIB肉汤培养24h后，每管肉汤培养物分别接种到相应BEA平板、BHIB肉汤及含6.5%氧化纳()JaCl)的BHIB肉汤中。BEA平板及含6.5%氧化纳(NaC
10、l)的BHIB肉汤置350C士0.50C培养48 h士2h;BHIB肉汤置450C士0.50C培养48h士2h，观察细菌生长情况。8.1.5.2 BHIA斜面培养48h后，从斜面上挑取菌落作革兰氏染色。8. 1. 5. 3 革兰民染色镜检为革兰氏阳性球菌;在BEA平板上生长井水解七叶昔(形成黑色或棕色沉淀);BHIB肉汤中450C士0.50C生长;并且在含6.5%氧化纳(NaCl)的BHIB肉汤中350C士0.50C生长良好;具有以上特性的典型菌落可确证为肠球菌。8.1.6 菌落计数对确证为肠球菌的菌落进行平板计数，生长有30个300个肠球菌为计数合适范围。8.1.7 结果计算8. 1. 7.
11、 1 用所选择计数的每个平板上典型肠球菌的菌落数，乘以确认为肠球菌的菌落所占比例，以此求出所选取的同一稀释度两个计数平板的肠球菌菌落数。示例:10-1稀释样液的两个平板上分别有85个和90个菌落，每个平板所挑取的10个典型菌落中，确认为肠球菌的分别有8个和9个，则此稀释度的两个计数平板上肠球菌菌落数分别是85X (8/10) = 68及90X (9/10) =81 0 8.1.7.2 若只有一个稀释度平板上的肠球菌菌落数在计数合适范围30个300个之间，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值除以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。8.1.7.3 若有两个连续稀释度在适宜计数范围内时
12、，按式(1)计算:N 一一三主(1十0.1n2)d式中:N 样品中肠球茵茵落数;I:C 两个连续稀释度平板(含适宜范围菌落数的平板)肠球菌菌落数之和;nl 适宜范围菌落数的第一稀释度(低)平板个数;n2 适宜范围菌落数的第二稀释度(高)平板个数;d 第一稀释度的稀释倍数。示例:稀释度菌落数1 : lO(第一稀释度)245.247 N主(1 + O. 1n2)d (245十247十31十30)叮叮A(2十0.1X 2) X 10-1二0吨上述数据经修约后，结果表述为2.5X 103 CFU/g(mL)。1 : lOO(第二稀释度)31.30 . ( 1 ) 8. 1. 7.4 若所有稀释度(包括
13、液体样品原液)平板均无特征性菌落生长，则以小于l/d(d最低稀释倍数)计算。8. 1. 7.5 低数值的估算:如果实验样品原液(水及液体饮料)或初始稀释悬液(其他食品)的两个琼脂平4 SN/T 1933.1-2007 板上的菌落数均小于30个，计算两个琼脂平板上菌落数的算术平均数。计算方法见式(2):C一ZL 一E N . ( 2 ) 式中:NE 每毫升或每克样品中肠球菌数的估算值;三=c两个琼脂平板上肠球茵茵落数的和; 琼脂平板的数量;d 样品初始悬液或实际接种悬液的稀释倍数。8. 1. 7.6 大数值的估算:若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，计数最接近300个菌落数的琼脂平板上的菌落
14、并计算出算术平均数。其他平板可记录为多不可计。结果计算见式(3):2.: C NF二豆豆( 3 ) 式中:NF 每毫升或每克样品中肠球菌菌落数的估计值;2.: c 两个琼脂平板上肠球菌菌落数之和; 琼脂平板的数量;d 与样品悬液相一致的稀释倍数。8.1.8 结果表述方式8.1.8. 1 菌落数在100以内时，按有效数字修约规则修约，采用两位有效数字报告。8.1.8.2 菌落数大于或等于100时，前第3位数字采用有效数字修约规则修约后，取前2位数字，后面用。代替位数来表示结果;也可用10的指数形式来表示，此时也按有效数字修约规则修约，采用两位有效数字。8.1.9 结果报告固体样品以CFU/g为单
15、位报告，液体样品以CFU/mL为单位报告。8.2 最近似值(MPN)测定法8.2. 1 适用范围此方法适用于污染程度低的样品，检验含有受损伤的肠球菌的加工食品及肠球菌菌数小于等于10 CFU/g(mL)的水和食品。8.2.2 接种根据样品污染情况，选择3个适宜连续稀释度的样液，分别吸取1mL稀释液，接种于叠氮化纳葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤，每个稀释度加3管。接种量为1mL时，使用10mL单料管;对于低污染样品，将10mL最低稀释度的样品液加到等体积的双料培养基中。8.2.3 培养接种后的肠球菌肉汤置350C士20C培养24h士2h，肉汤颜色变为黑色的试管，表明有肠球菌生长。一般有肠球菌生长时，肉汤
16、颜色在2h内即可变为黑色。接种后的叠氮化铀葡萄糖肉汤置360C士10C培养24h士2h，检查各试管由浊情况。若元1昆浊，继续培养至48h士2h后记录结果。8.2.4 确证试验8.2.4. 1 对所有呈现混浊的叠氮化铀葡萄糖肉汤管或颜色变为黑色的肠球菌肉汤管进行确证试验。用接种环将各管的培养物划线接种于KF平板或肠球菌琼脂平板。KF平板置360C士lOC培养48h士2 h;肠球菌琼脂平板置350C士20C培养24h士2h。8.2.4.2 肠球菌属细菌在KF平板上形成暗红至粉红色菌蓓，边缘整齐;在肠球菌琼脂平板上形成带5 SN/T 1933.1-2007 棕色环的棕黑色菌落。用灭菌接种针从KF平板
17、或肠球菌琼脂平板挑取10个可疑菌落，按8.1. 5所述进行确证试验。8.2.5 最近似值MPN8.2.5.1 如一管培养物中所挑取的典型菌落中，有一个菌落确认为肠球菌，则该管应视为阳性。8.2.5.2 根据接种的样品量和确证为肠球菌的阳性反应管数，查MPJ值表(参见附录剧，得出样品中肠球菌最近似值。8.2.6 结果报告肠球菌MPN/g(mL)。6 A.1 叠氧化制葡萄糖肉汤A.1.1 成分牛肉浸膏膜蛋白陈葡萄糖氧化纳叠氮化专内蒸馆水A. 1.2 制法4.5 g 15.0 g 7.5 g 7.5 g 0.2 g 1 000.0 mL 附录A(资料性附录)培养基SN/T 1933.1-2007 将
18、上述各成分?昆匀，不断搅拌加热溶解。每管分装10mL，121C高压灭菌15min，调节pH至7.2，若制备双料浓度的叠氮化纳葡萄糖肉汤，可将上述配方蒸锢水改为500m L, A.2 肠球菌肉汤A. 2.1 成分膜蛋白陈17.0 g 牛肉浸膏3.0 g 酵母浸膏5.0 g 牛胆粉10.0 g 氧化纳5.0 g 拧橡酸号内1. 0g 七叶昔1. 0g 拧橡酸铁锻0.5 g 叠氮化专内0.25 g 蒸锢水1 000.0 mL A. 2. 2 制法将上述各成分加热煮沸榕解冷却后，调pH至7.1士0.2，分装，121c高压灭菌15mi口，备用。A.3 KF链球菌琼脂A. 3.1 成分蛋白陈10.0 g
19、酵母浸膏10.0 g 氧化纳5.0 g 甘油磷酸铀10.0 g 麦芽糖20.0 g 乳糖1. 0g 叠氮化纳0.4 g 琼脂20.0 g 7 SN/T 1933.1-2007 蒸锢水A. 3. 2 制法将各成分加热溶解，用10%的碳酸铀调整pH值至7.2，121C高压灭菌15min，冷却至50C60C 时加入无菌1%氯化三苯四氮唾水溶液10mL, YEA m nu nu nu nu ti A.4 肠球菌琼脂(胆汁七叶昔叠氨$内琼脂)A. 4.1 成分膜蛋白陈17.0 g 牛肉浸膏3.0 g 酵母浸膏5.0 g 牛胆粉10.0 g 氯化专内5.0 g 拧橡酸号内1. 0g 七叶昔1. 0g 拧橡
20、酸铁锻0.5 g 叠氮化纳0.25 g 琼脂13.5 g 蒸馆水1 000.0 mL A. 4. 2 制法121 c高压灭菌15mi口，灭菌后调节pH至7.1，于45C50C保温培养基，从保温开始至倾注平板的时间不要超过4ho A.5 胆汁七日十昔琼脂A. 5.1 成分蛋白陈胆盐拧攘酸铁七叶昔琼脂蒸锢水A. 5. 2 制法将各成分加热溶解，121c高压灭菌15mi口，调节pH至7.1士O.2。冷至45C50C倾注平板。8.0 g 20.0 g 0.5 g 1. 0g 15.0 g 1 000.0 mL A.6 脑心浸液肉汤(BHIB)A. 6.1 成分牛脑浸出粉牛心浸出粉1夷蛋白陈葡萄糖氧化纳
21、磷酸氢二铀蒸馆水10.0 g 9.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 1 000.0 mL 8 SN/T 1933.1-2007 A. 6. 2 制法将各成分加入蒸馆水中，加热溶解，调节pH至7.4士0.2，分装，121c高压灭菌15mino A.7 含6.5%氢化铀(NaCI)脑心浸液肉汤A. 7.1 成分除加入氯化铀(NaCl)，其余成分与BHlB相同。A. 7. 2 制法每升BHlB中加60.0g氯化铀()JaCl)，其余制法与BHlB相同。A.8 脑心浸液琼脂A. 8.1 成分除每升BHlB加15.0g琼脂，其余成分与BHlB相同OA. 8. 2 制法称取52g无
22、水BHIA溶于1000 mL蒸馆水中，加热溶解，每管分装10mL, 121C高压灭菌15 mi口，制备成斜面，调节pH至7.4士O.20 A.9 缓冲蛋白脏水A. 9.1 成分蛋白陈氯化纳磷酸氢二铀磷酸二氢饵蒸悟水A. 9. 2 制法10.0 g 5.0 g 9.0 g 1. 5g 1 000.0 mL 按上述成分配好后，调节pH至7.2，每瓶分装225mL, 121C高压灭菌15mino 9 SN/T 1933.1-2007 附录B(规范性附录)1 g样品中最近似值(MPN)表表B.11 g样品中最近似值(MPN)表阳性管数/g(mL)阳性管数/g(mL)MPN 儿1PNO. 1 O. 01
23、 0.001 O. 1 0.01 O. 001 o o o 1 100 注:表内所列样品量如改为1日(mL).O. 1日(mL) O. 01 g ( mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改为0.01日(mL).0. 001 g(mL) .0. 000 1日(mL)时，则表内数字相应增加10倍，其余可类推。10 hCON-气的的白二军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品和水中肠球菌检验方法第1部分:平板计数法和最近似值测定法S:f/T 1933.1-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X12301/16 印张1字数20千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000 定价10.00元-兴书号:155066 2-18076 SN/T 1933.1-2007
