1、s 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1938-2007 蜜蜂白圭病检疫规范Quarantine protocol for chalkbrood disease of bees 2007-08-06发布2008-03-01实施岛部jVAP-v、飞中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准蜜蜂臼歪病检在规范S:-I!T 1938-2007 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045同址、IVWW.spc. net. cn 电话6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷陆开本880X1230 1/16
2、印张O.75 字数16千字2007年11月第一版2007年11月第一次印刷印数1-2000 书号，155066.2-18193 定价12.元前言本标准的附录A是规范性附录，附录B、附录C和附录D是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人z郑腾、孙颖杰、张志灯、白泉阳、赵兴存、王武军、李志方。本标准系首次发布的出人棱检验检疫行业标准。SNjT 1938-2007 I SN/T 1938-2007 蜜蜂自圭病检瘟规范1 范围本标准规定了蜜蜂臼里病的检疫规范.本标准适用于蜜蜂自主病的检疫.可用于蜜蜂蜂球囊菌的分离与鉴
3、定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准战马庭再属必本标准的条款F品是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括助误内容)或叫版均不运用于本标准，然而，鼓励咿本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡龙不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用7具规格和试验方法中GB 19489 实验室生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本标3. 1 蜂王queen bee 又称母睬，是由受精卵发育而蜜蜂品种种性的载体，并起到团结蜂群的作用。3.2 工蜂worker bee 3.5 巢脾comb / j / / / 一般是由12日龄-18
4、日龄的工蜂分泌蛤鳞筑造而成，每片巢脾称为子1牢。从事选膊的工蹄，吸饱蜂蜜后连成串串蜂链，悬挂在造脾施工点或附近，数小时后，蜡液外泌到蜡镜并凝固成始鳞，经充分咀嚼并混入上顿腺的分泌物后，将成海绵状的蜡块固定在巢脾上。3.6 封盖巢房capped ceIl 在子牌上，封盖子一般位于巢脾的中下部，巢房呈黄褐色，形状规则，轮廓清晰s封盖蜜则位于巢牌的上部至两角向下发展，色浅，巢房轮廓不清晰，具波浪纹。西方蜜蜂雄蜂房封盖突出，似馒头状。SNjT 1938-2007 4 检验检疫4. 1 设备、材料和试剂4. 1. 1 设备4. 1. 1. 1 光学显微镜.4. 1. 1. 2 恒温培养箱.4. 1.1.
5、 3 超净工作台.4. 1. 1. 4 药品冷藏箱(2C-8C)。4. 1. 2 材料4. 1. 2.1 元商培养皿。4. 1. 2. 2 载玻片。4. 1. 2. 3 试管(10mL)。4. 1. 2. 4 无菌银子。4. 1. 2. 5 元菌解剖刀。4. 1. 2. 6 元菌解音rJ剪。4. 1. 2. 7 移液器。4. 1. 2. 8 血球计数板。4. 1. 3 试剂4. 1. 3. 1 试验用水2本标准所用水应符合GBjT6682中三级水的规格要求。4. 1. 3. 2 乳酸苯盼固定液(配方见附录A)。4. 1.3.3 乳酸棉蓝染色液(配方见附录A)。4. 1. 3.4 75%酒精。4
6、. 1. 3. 5 O. 85 %元菌生理盐水。4. 1.3.6 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(配方见附录A)。4. 1.3.7 醉母粉。4. 1. 3. 8 氯霉素。4.2 检验检疫方法4.2. 1 现场检验检疫4.2. 1. 1 箱外检查患病蜂群的蜂箱口可见被工蜂拖出的幼虫干尸，质硬，有的于尸呈苍白色，似葵花仁状，表面有一层绒毛膜，掰开幼虫于尸可见内心为浅棕色;有的干尸为部分或全部黑色，似西瓜子状，表面有一层黑色颗粒状物质(参见附录B)。4.2. 1.2 开箱检查从患病蜂群的蜂箱中提出幼虫的封盖子牌，在已封盖的部分有呈星点式分布被工蜂咬开的巢房，可见内有向一伽l贴壁的幼虫干尸，形态完整，质地柔韧
7、，无光择，元臭味，用摄子取出后，可见有的为白色，有的为部分或全部黑色。健康的蜜蜂幼虫是呈有光泽、珍珠样外观(参见附录。4.2.2 采样4.2.2.1 采样比例当蜂群数量小于或等于10群时，所有蜂群均采样。当数量在10群-100群时，以10丰采样量为基础，每地加10群，采样量增加1群。当蜂群数量为101群-200群时，按总群数的15%采样。当蜂群数量为201群以上时，按总群数的10%采样。采样时，每群蜂取10只-20只幼虫送实验室检疫。着现场检验检疫时，发现蜂群疑似感染蜂球囊商时，可以根据实际情况，增加采样的比例。2 SN/T 1938-2007 4.2.2.2 采样方法从每个蜂群巾随机抽取子脾
8、一张，按照5点式采样方法，分别从巢脾四角与中央各开启封盖幼虫房2个4个，观察是否有患病幼虫存在。采样时，应尽量元菌采集变色或死亡)J虫尽快送实验室检查，样品可保存于zC8C的条件下。4.2.3 实验室检测4.2.3. 1 镜检法取虫尸样品于无菌培养皿中，用经消毒的解剖刀刮取样品表面物质置于干净的我玻片上，加1涡2滴无菌蒸惚水或乳酸苯盼固定液，在显微镜下观察，可见呈白色的似棉花般的菌丝或黑色的含有于包子球的抱寰。也可用乳酸棉蓝染色液进行染色，染色后茵丝呈蓝色。4.2.3.2 分离培养元菌操作条件下，将虫佯剪成1mmXZ mm的小方块，置于75%的酒精中消毒2min后接种于病原的分离培养基(自己方
9、见附录Al平板上，35C下培养5d7 d，逐日检查茵丝生长和于包装产生的情况，待抱亵产生后挑取抱囊纯化至纯培养。若还有采集蜂蜜样品，每个蜂蜜样品取5mL，加人5mL 0.85%的无菌生理盐水，充分混合均匀，在3个无茵培养皿中分别加入1mL的衍释样，再加入约10mL 15时，病原前分离培养基，35C下培养5d7 d，逐日检查茵丝生长和抱囊产生的情况，待于包褒产生后挑取抱囊纯化至纯培养。按利针分别挑取少量的商丝和子实体置于我玻片上，加1滴2滴元商茶馆水或乳自主末盼固定液，在400倍600衍的显微镜下观察，可见树枝状分支的有隔菌丝和墨绿色泡囊，泡褒内含有许多大小不等的抱子球，破裂的抱褒可梓放出大量的
10、子囊抱子。也可用乳酸棉蓝染色液进行染色，染色后茵丝呈蓝色。4.2.4 动物感染试验以下试验应在严格的隔离设施中进行，并应符合GB19489中有关实验室的生物安全要求。将已分离纯化的蜂球囊菌接种于病原商分离培养基，35C培养5d7 d，待泡王军发育成熟并释放出子囊袍子时，用灭茵蒸倒水将产生抱囊的菌丝制成菌悬液，每毫升菌悬液至少应含有2X 10个抱子。选用元病群健康的西方蜜蜂幼虫脾，以1日龄2日龄健康的西方蜜蜂幼虫为试验对象，以灭菌蒸惚水为对照液，用移液器分别给健康的)J虫滴喂菌悬液和对照液，滴喂最为2L。蜜蜂幼虫经滴眼商悬液后，第1天至第3天元异常，感染幼虫与健康幼虫无明显仄别。肯14天起有部分
11、感染幼虫出现死亡，随后每天的死亡数量逐日增加，第6天至第7天时死亡量达到高峰。第10天左右死亡幼虫体壁开始长出白色茵丝，开始呈苍白色，继而发展为暗灰色，继续发展变成但硬的石灰质块。幼虫发病初期膨胀柔软，腹面出现茵丝，巢房壁上也粘有茵丝。至中期虫丰布满ri丝，较初期萎缩且逐渐硬僵化，形状似粉笔块，部分虫体有黑色子实体覆于体表。病至末期，部分虫体被成年工蛇拖出巢房，散布于箱底、箱门口或蜂箱前地回。留有自主病幼虫尸的巢房口被一层白色或淡黄色的li丝封闭。4.2.5 结果判定在现场检验检疫时，若见到巢门前、箱底或巢脾上有长有白色茵丝或黑白两色的幼虫尸等临床症状时，可做出初步判断。在分离培养时.可见蜂球
12、囊菌的菌落呈白色，较致密，中央凸起，茵范老化时颜色变成x棕包至棕色。雨丝多旦分支状，二叉分枝间距较大，菌丝体呈疏松的蛛网状。商丝均匀JH苗踊膜，直径为2.5 tLm 6.0p_m，菌丝细胞多核，雌性茵丝能长出有横隔壁隔离的藏卵器，雄性菌丝能形成体在HfI小的主纺锤形的藏柏器，雌雄茵丝相交后几小时内即可形成黑色的抱子带，而同性茵丝相交处则没有黑色的抱子带，有时两性商丝混合长成一个菌落，往往成为不规则的黑色抱子带。Jl检时，蜂f:J囊茵的子实体为特征性的鉴定部位，墨绿色的抱囊呈球形(参见附录Dl，l外向内有SNjT 1938-2007 3层结构g最外层为墨绿色的闭囊壳，其中包裹着许多球形的子囊，子
13、囊元外膜，子囊中又有大量的椭圆形的子褒抱子，不同子囊果中子囊的大小和数目也有不同(参见附录0)。待子实体成熟后，子褒应消融，子囊抱子积聚成为袍子球，并被有外膜。子囊及带有抱子的子囊在该菌生长过程中很少见，一般待抱赛成熟，子囊壁已不存在，所以显微镜下看见的抱囊内的球形抱子团只是抱子球，每个袍子球的大小不一，内含的抱子数也不同。成熟的抱囊会自行破裂，释放出抱子(参见附录D)。蜂球囊商有两个变种，即大抱球囊霉和蜜蜂球囊霉，其区别在于成熟的滋养细胞和抱囊、于包子大小不同，两变种问彼此不能杂交.蜜蜂球囊霉的抱囊直径通常为32m-99m，平均为65.5m，抱子(3-3.8)mX(1. 5-2. 3)川大抱
14、球囊霉的抱囊直径一般为88.4m-168.5m，平均128.4m，于包子比前者大10%。一般通过现场检验检疫、分离培养和镜检后，即可对蜜蜂白主病进行确诊。若需要时，可以结合动物感染试验，做出主主终判断。4 SN/ T 1938-2007 附录A规范性附录)固定液、染色液和培养基的配方A. 1 乳酸苯酣固定液的制备乳酸10mL，结晶苯酣10g，甘油20mL，蒸馆水10mL.将由)、乳酸、甘油混合，徐徐加热洛解即可。A. 2 乳酸棉蓝染色液的制备乳酸20mL.结晶苯酣20g . 油棍合.徐徐加热溶解后，加入巾，置显微镜下观察。A.3 马铃薯葡萄糖琼脂培养基A.4 病原菌分离培养基的制备马铃薯葡萄椭
15、琼脂培养基O. 05 MPa的压力下，高温灭菌5 g.蒸i留7120 mL.将酣、乳股、甘于载玻片上.挑取待检菌于染液- 40 min，过j虑，将20g葡萄糖和20g J)j ，将以上各种成分混合溶解，在5 SN/ T 1938-2007 附录B资料性附录蜜蜂自圭病发病蜂群的巢口死虫和病虫症状图阻1巢口死虫图.2病虫状态6 SN/ T 1938- 2007 附录C(资料性附录)蜜蜂自歪病发病蜂群的病脾状态固C.1病脾状态SN/ T 1938-2007 附录D(资料性附录蜂球囊菌子实体的显微固像固D.1抱囊圄D.2包含子囊抱子的子囊围D.3破裂的抱囊书号:155066 2-18193 SN/ T 1938- 2007 定价:12.00元
