1、中华人盹共和入境接行标准SN/ T 1942.2-2007 进出口动物耀性食品中布鲁氏菌瞌方法第2部分:PCR检验方法Detection of Brucellin food from animal for impor and export-. . 吃2! PCR method 2007由08-06发布2008心3咱们实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局削昌S只/丁19112-20077氏!f!i 计数方法物丰11废弃物应小JL少，无动力，无芽胞，ji使用两段(通常长度为15个25个核昔酸)寡脱氧棋?于酸作为反应的引物，这两段引物序列发生:互补作用，可以在!作为模板的待UDNA两条链上
2、的特定位点分别发生互补。反应液包括离子的反应缝*t豆、4种脱轼核三磷酸CdNTP)、模板DNA、引物及热I)NA聚合酶偎化下，通过DNA变性、退火及延伸数十个概环的反复变化市DNA片段的大壁拷贝彷942.2 2007 5. 1. 3 引导勿pdmcr 成一对肉剧DNA序夕iJ的宾;核背自空9作为PCI之号i物。5.2 绵路语夕IJ丁1942的本部分，.5. 2.1 PCH;巳ch乱inreaction(PCR) , 5.2.2 DNA:d伫acid，丘之3dNTP: 5.2. 12 Tris:tris( 5.2.13 口俨t 巧11;窍。5.2.4 dATP: 5. 2. 5 clCTP: 5
3、.2.6 dGTP: triphosphate , 5.2. 7 dTTP:d巳oxythymidinetriphosphate，脱氧胸奸5.2.8 dUTP : dcoxyuriclin巳5.2. 9 UDG , uraci DNA 5. 2.10 bp: ba引5.2. 11 6 手段试割6售16 2 6. 3 6. 4 6.5 .水! TGCCrCGG TTC;CCJ飞ATATTCAA3f51 CGCGC丁TG仁CTT丁C/GC丁C丁(六36. 6 6. 7 6. 8 (丁扣1CC55008L扎去(丁?飞dCJ沪、dGTP( f吏以下种即可): 布鲁氏日录:号为丰布CMC(二,CMCC2
4、59Z 2 6, 9 6院106. 1 6.12 6.13 6.14 6. 15 Tris HCl(pII8. 0)、1ED丁J飞(pH8.0。pH 8.4)、KCL 57 . 1 rnL、().20 mL 50 T人仨1El，乏主冲二1 000 mL前，用液1l1可6. 16 10X加样:辍冲液:1%SDS、50%(体积比HJ油、0.05%C质7 仪器和设备7.1 电子天平:!总量为0.001g 7.2 PCRf.义。7. 3 离J心和l，.7. 4 紫外凝胶成像义。7.5 电咏仪。度)y船班。7. 6 做墨:移1良器:0.5/).1.、2f!.L、10L、20L、100/).L , 200
5、L、1000L。7. 7 恒瓶培养箱。7.8 tl泪水浴锅。SN/T 1942. 2-2007 7. 9 做需氧培养设备:最佳般市辄条lJ)5%氧气、10%二氧化嵌和185%氮气。可Fll具双相压力计的厌氧罐、蜡她缸、气袋;或其他可代用的装置。8 检验方法8. 1 方法提要食品经增幽培养后，采用细菌器问纤I.DNA提取试JfIJ盒提取D挝人，以提取的DNA为榄板进行PCI扩增，瑜、脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条辛苦;从而对食品中是否污染布鲁氏菌属进行快速检验。8.2 检验程序布鲁氏菌j离PCR检验程序见!到10样i;，)25 g (mL)加到225mL布鲁氏I肖肉汤J者养怒中36.C士
6、1.CI 72 h 提取细盲目DNAPCR检l盘tli! Ji 圈1布鲁氏菌腾PCR检验程序3 SN/T 1942.2-2007 8. 3 步嚷8.3. 1 增菌以元菌操作称取食品试样25rnL(g)，加至IJ含有225mL布鲁氏菌肉汤培养基的灭菌广口瓶内.振摇使样品充分说匀后，分别于有氧和做需氧条件下，36C士1C恒温培养72h Q 8.3.2 模板DNA提取取布鲁氏蘑肉汤培养基J.5 mL, 10 000 r111n离心2mi口，尽量销尽上清液。按细雨基因组DNA提取试开IJ盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNAi容于50;, TE中。剩余布鲁氏菌肉汤增的液分别于有氧和微帘轼条件下
7、36C:!:lC l:ii跑过夜培养，以备确证试验使用。8.3.3 PCR扩增(可参照相关试剂盒操作说明)反应体系体积50，1L:JOXPCR缓冲液CMgZ十Plus)5 p.L，51物对(20p mol/L)各O.5L，dNTP (2. 5 mmol儿)4L、TaqDNA翠在胞函品品品品品挝品极藏据边脸A1L、水补足至50L.反应条件:93C预变性5111黯罐攘攘概翻腾翻黯蠢蠢罐罐C延伸60s，l投行40个循环.72C延8.3.5 PCR扩增产物电泳栓验用50XTAE电球缓冲液应终浓度达到1g/t叫，1M胶。在分别和1.5L6X加l样缓冲8.4. 1 PCR扩增产物电泳检验布鲁氏菌属PCR扩
8、增产8.4.2 结果判断阴性别照和空白对Jl在均未扩增条带，怀疑存在布鲁氏菌8. 4.3 确证试验取36C土1c恒强培养的可疑商;在并进行J鉴定。8.4.4 错果表述鲁氏菌标准商株和大肠埃希氏商标氏虚fJ高DNA胶未凝固时加入澳化乙提使其最A ladder 0 9 V/cm 1需用.电惊条带:待llJ样品出现预期大小的的扩增条带.为阴性结果。19，12.1中6.3.3的分离方法，担取PCR扩增产物电泳检脸结果阳性，且经确证为非假阳性电报告该食品中检出布鲁i无菌CPCR扩增产物电泳检验结果阴性，1告该食品中未检出布鲁氏菌。8. 5 腹弃物处理和防止污染的措施检验过程中的废弃物，收集后焚烧处理6检
9、验过程巾防止交叉污染的措施按照附录旦中的规定执行。4 A.1 布氏肉汤A.1.1 成分腕酷蛋白牛肉葡萄糖酵母授膏氧化钙3在亚硫酸纳燕储水A. 1.2 制法将各成分加入蒸情水r:11，JJII热并最终pH7.3土0.20A.2 布氏琼黯A. 2.1 成分腆i黯蛋白牛肉夜宵葡干白糖酵母夜宵氧化钙重亚硫酸饷琼脂蒸t留水A. 2. 2 辈们去:1守备成分加入蒸情(中，加热并终pH7.:土O.20 A.3 肝浸液培养基A. 3.1 成分肝浸液蛋白陈氟化饷琼脂A. 3. 2 您们去附录A(规范性附录)培养基和试剂10. 0 g 10.0 g 1 000 mL 10 . 0 g 5. 0 g 15. 0 g
10、 SN!T 1942. 2-2007 全溶解，121C高压灭菌15 min，最将各成分加入蒸榴水中，加热并不断搅拌，煮沸1m巾，使琼JJ旨完全溶解，121C高压灭菌20min，最终pH6.9之O.2。d SN/T 1942. 2-2007 A.4 膜蛋白服培养基A. 4. 1 成分膜蛋白)1在氧化饷蒸锚水A.4.2 制法20 . 0 g ;).0 g 1 000 mL :吁各成分加人类在?留水中，加热并不&i搅拌，煮沸min，使各成分完全路解.1210C高H灭菌15rnin , 最终pH7.2十0.2。6 SN/ T 1942缰2-2007附录B(规范性附录)检验过程中防止交叉污染的蜡施B.
11、1 抽样和制样过程抽样和制样，工具，应清洗干净.1210C高压灭菌15min-20 mi口，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、离f王;灭菌，或为一次性无菌容辙。B.2 检验过程B. 2.1 PCR实验在应分为样品制各i墨、前PCR区、PCR区和后PCRIX。将模板提取、PCR反应液配制、PCR俑环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区!.iX;分室进行。实验室的运作服从洁净底到污染区单向进行。8.2.2 实验过程中，应穿实验服、戴手套号子套要经常换。各区要有专用实验服，经常清洗0B.2.3 各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。B. 2 4 所有溶
12、液、水、耗材和器具要1210C高照灭酶15min，避免污染。每种榕掖应使用分析纯试剂和新蒸馈的双蒸水。在200C250C贮存的试剂中，口J加入0.025%的普氮化锅。所有试剂配制后，应分装成仅够一次使用的量进行贮存。B. 2. 5 DNA模板或引物的离心管打开之前，要4000r/min离心10S，离心管不能用力崩开，以免产生气溶脏。B. 2. 6 -1前PCR区中，最好能在超净台或生物安全柜中加入PCR反应各组分。B. 2. 7 实验前后，实验室用紫外找消毒及通过反复清洗、擦拭去除各种器具和设在告表面残阔的DNA.8.2.8 可使用UDG和dUTP系统控制污染。8 .2.9 应遵循PCR操作的其他要求。hCC内vilp州飞吨。FrFhdHU中华人民共和困山、1迸出口动物辉性食品中检验方2部分:PC及SN/了19，12.2200/11囡标准出版社出版北京友兴门外理部:it1tl16号; J ()()()43 问坦l: 68523946 6851/548 出.岛印拟j印刷印张O.75 字数14千字2007年11月第一次印刷我版印数0001116 中国Jl二本880 1230 2007年11月cl5号155066 2-18200 SN/T 1942到2-2007
