1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法SN/丁19432007 兴中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北衔16号邮政编码:100045网址www.spc.口et.c口电i舌:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷提开本880X12301/ 16 印张O.75 字数16千字2007年11月第一版2007年11月第一次印刷印数1-2000 兴书号155066 . 2-18225 定价8.00元, SN/T 1943 2007 小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法1 范围本标准规定了小麦中转基因成分PCR和实时荧
2、光PCR检测方法。本标准适用于小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR的定性检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的修改单(不包括勘误的内容)或修是否可使用这些文件的最新版本。, . GB/ T 6682 分析实验室用水规格和实验方法SN / T 1193 基因检测实验室技术要求SN / T 11 94 植物及其产品转基因成分3 术语、定义和缩略i吾3. 1 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1. 1 转基因transgene 将物种本身不具有的、来源于其他种中表达，以便该物种获得新的性状3. 1. 2 转基因成分genetically modi 白色nent 物种本身不具
3、有的、而是来源种的3. 1. 3 内源基因endogenous 在转基因作物基因组中拷贝数该基因即可用于评价样品中是否存在测，同时还可确定DNA提取是否成功、并验3. 1. 4 外源基因exogenous gene 列。因变作为参反应体系日期的引用文件，其随后所有本标准达成协议的各方研究本适用于本标准。生物学于段导人，使其在该物他品种作物中不存在的基因。列对某一目的基因进行定量检否存在抑制物质。利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。3. 2 缩略语下列缩略i吾适用于本标准。3. 2. 1 bar: phosphinothricin acetyltransferas
4、e gene from BacilLusylliquefaciu五，来源于杆菌BcilLmyluliquefCl川草丁瞬乙酌转移酶基因。3.2.2 Ct: cycle threshold，每个反应管内的荧光信号达到设定阁值时经历的循环数。3.2.3 GAG56D:triticm aestivum partial GAG56 D gen巳forgammagliadin，小麦醇梅蛋白基因CGeneI妇nk编号:GI: 10638295)。是小麦属特异性内源基因。3. 2.4 NAC : no amplification control，阴性对照。l -悔于蒸馆水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。
5、7. 17 10X上样缓冲液:含0.25%澳酣蓝，0.25 %二甲苯青FF，30%甘1I水洛液。7.18 PCR反应缓冲液。7. 19 UNG国每。8 仪器8. 1 基因扩增仪。8. 2 电咏仪。8. 3 电泳槽。8. 4 凝胶分析成像系统。8.5 紫外可见分光光度计。8. 6 天平:感量1mg ,O. 1 mg。8. 7 高压灭菌锅。8. 8 超低温冰箱。8.9 冷冻离心机。8. 10 水洛锅。8. 11 微波炉。8. 12 微量加样器:2. 5 f-1L, 10L，20L， 100L，200L，l 000L 8. 13 PCR反应管:200L，500L两种规格。8. 14 Eppendor
6、f离心管:L5mL，2.0mL。8. 15 实时荧光定量PCR仪。8. 16 超净工作台。8. 17 超纯水器。8. 18 游涡振荡器。9 检测方法9. 1 小麦基因组DNA的提取9. 1. 1 CTAB;去SN/T 1943一2007称取0.2g粉碎后的小麦样品于2mL离心管中，加入1mL CTAB裂解液，混匀，650C水浴保温30 min，不时振荡;12 000 r/min离心5min;小心取离心上清液，加入等体积的三氯甲皖/异戊醇(体积分比24: 1) y昆匀，静止5min , 12 000 r/mi口离心5min;取离心上清液，再加入等体积的二氧甲皖/异戊醇(体积比24: 1)氓匀，静
7、止5min , 12 000 r/min离心5mi日;取离心上清液加O.65倍体积的异丙醇，?昆匀，12000 r/ min 40C离心10min;弃上清液，力1500L 70%冰乙醇洗涤-次，12000 r/min 40C离心5 min;弃上清液，将沉淀晾干，加入50LTE，梅解沉淀(40C过夜，或370C保温1h);40C保存备用。每个实验室样品应制备两个测试样品和提取空白对照同时提取DNAo9. 1. 2 试剂盒法小麦总DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒。9.2 核酸纯度和浓度的定样品中提取的DNA做适当稀释，放入紫外分光光度计的比色杯中，于260nm处测定其吸收峰，1 OD2
8、6() mm = 50g/mL双链DNA .!l!Z 38g/mL单链DNA。紫外分光光度?去检测核酸浓度的最佳JE围是2g/mL50f-1 g/ mL , OD值应该在0.051范围内。PCR级DNA陪液的002600l1ll / 0 D:2 80 Illm的比值为1.72.0o3 、SN/T 1943 2007 的外师、基因Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品检出xxx基因。再次扩增后的外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品未检出xxx基因。9.6 结果表述该样品未检出xxx基因。该样品检出xxx基因。D 4
9、 SN/ T 1943 2007 表A.3小麦内外源基因定性PCR检测的反应体系试剂名称储备液浓度加入体积/L10 X PCR Buffer 2. 5 氯化筷(MgCl，) 25 mmol/ L 2. 5 clNTP 2. 5 mmol/L 2. 0 引物(上游、下游)10 pmol/ f1 L 1. 0 7q 每5 U/ I, L O. 2 DNA模板0.3g/L6g/L 2. 0 cl cl l-l, () 补足总体积为25L注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。表A.4小麦内外源基因定性PCR检测的反应参数被检测基因预变性扩增循环数后延伸bar 04C . 5 mi
10、n 94(.30 s;58(.40日;720C，15n111135 72C .1 0 min NOS 94 ( . 3 min 94( . 20 s ; 54C , 40 s , 72C , 1 min 40 72( , 3 min uidA 94C . 5 rnin 94 C , 1 rn in , 62C啕1min; 72C .1. 5 m门140 72C , 10 min ubiquitin 94 C . 5 min 94( . 30 s ; 54C . 30 s ;72C , 1 min 35 72C . 10 min Wx012 95C.10mi口9oC . 30 s , 63C .
11、 30 s ; 72C . 30 s 40 72C , 7 min GAG56D 9.1飞.5mln94C . 30 s ; 61C . l min , 72C ,1. 5 min 35 72(，10m门1注PCR反应循肝、参数可根据基因扩增仪器型号的不同进行适当调整。表A.5实时荧光PCR定性检测小麦内外源基因的反应体系和反应参数试?刊名称终浓度加入体积(f( L) 10 X PCR Buffer 1 X 25 氯化读CMgCl, ) (25 mmo) 2. 5 mmol/ L 2. 3 cI-JTPC含clUTPlC 2. 5 mrno) 0. 2 mmol / L 2. 0 UNG 1i)(5 U/fd.l 0. 075 U O. 375 上游引物什opmol / f1Ll 0.2 pmol/L 1. 0 下游引物(lOprnol/ fl L) O. 2 prnol/L 1. 0 探针(5flmol / L) O. 2 pmol/L 1. 0 7、fli路(5U /Ll 2. 5 U O. 25 DN八模板50 ng/L 1. 0 liL 补水至补足水至2己L
