1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2215-2008 进出口动物源性食品中盼嘻曝类药物残留量的检测方法酶联免疫法2008-11-18发布Determination of phenothiazines residues in animal original food for import and export Enzyme-Iinked immunosorbent assay 2009-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本标准起草单位:中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人
2、g张晓峰、施伟良、汪云泉、朱振江、方莹。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SNjT 2215-2008 SN/T 2215-2008 进出口动物源性食品中盼唾曝类药物残留量的检测方法酶联免疫法1 范围本标准规定了动物源性产品中盼唾嗦类抗生素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于肉类、内脏、水产品和牛奶中氯丙嚓、乙酿丙嗦、丙酷丙嚓、丙嚓和三氟丙嗦残留总量的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本的修改单(不包括勘误的内容)是否可使用这些文件的最新版本。凡是不住日3 样晶的制备和保存3. 1 样晶制备组织样品:从全部样品中取装入容器中，密封，并标明标记。牛奶和奶粉:从原始包装中取封，
3、并标明标记。3.2 样晶保存将样品于一18C -20 C 4 方法提要本标准以碱性乙睛提取样被有氯丙嚓抗体，加入氯丙嗦氯丙嚓竞争性的与抗体结合。测定吸光度，根据吸光度值得出5 试荆和材料注日期的引用文件，其随后所有根据本标准达成协议的各方研究版本适用于本标准。分捣碎均匀，均分成两份，分别分成两份，分别装入容器中，密丙嗦和三氟丙嚓。微孔板中包嚓或提取液中残留物和酶标记，然后加入底物显色，用酶标仪除注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5. 1 吩噬嗦检测试剂盒(参见附录A), 5.2 乙睛。5.3 40%氢氧化制搭被:准确称取40.0g氢氧化饷，用水溶解并定容到100mL
4、。5.4 标准品:氯丙嚓，纯度二三98%;乙酷丙嗦，纯度二三98%;丙酷丙嚓，纯度二三98%;丙嚓，纯度二三98%;三氟丙嚓，纯度注98%。5.5 标准品溶液5.5.1 标准品储备液:分别称取5mg(精确到0.1mg)的氯丙嗦、乙酷丙嚓、丙酷丙嚓、丙嚓、三氟丙嗦，用甲醇溶解并定容至10mL，得到质量浓度为500mg/L的标准储备溶液。该储备液可以在一20c 避光条件下保存12个月。5.5.2 棍合标准品中间被:分别吸取各种标准品储备液0.2mL(丙嗦为0.1mL)于棕色定容量瓶，用 SN/T 2215-2008 甲醇定容至10mL，各种盼唾嗦类药物浓度为10mg/mL，可在20 .C避光条件下
5、保存3个月。5.5.3 、混合标准品工作液:根据需要以试剂盒中样品稀释缓冲液配制。6 仪器6. 1 酶标仪:具450nm擅长。6.2 8道移液器:10L-IOOL。6.3 单道移液器:10L-100L，20l1 L-200L，100L-1000L和2mL-10 mL。6.4 高速低温离心机:8000 r/min。6.5 电子天平:感量0.1mg . 6.6 氮吹仪。6. 7 组织捣碎机。6.8 旋涡混合器。7 分析步骤7. 1 提取称取5.0g样品(精确到O.1 g).置于50mL具盖聚丙烯酷离心管中，加入20mL乙脯(5.2)和0.5 mL 40%氢氧化铀溶液(5.3) .游涡棍合2min.
6、超声提取10min. 6 000 r/min离心5min.吸取2 mL上请被于干净试管，氮气吹至将干(注意不能吹干)，用样品稀释缓冲液(试剂盒提供)定容到1. 0 mL，即可供ELISA检测用。最后稀释倍数为2，7.2 测定条件1)7.2. 1 酶标仪测定条件酶标仪测定波长为450nm。7.2.2 洗板条件人工洗涤次数5次，每次加入洗涤液量为250L。自动洗板可以预定5次周期。7.2.3 操作条件所有操作应在室温下(20.C - 25 .C)进行，试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20.C-25 C)后方可使用。7.3 测定步骤7.3.1 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准搭液
7、及样品提取班等在微孔架上的位置。测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。7.3.2 吸取50L稀释缓冲液于孔A1、A2;分别吸取50L氯丙嗦标准溶攘(浓度分别为:0.05、O.1、O. 2、0.3、0.6、1.25和2.5ng/mU于孔Bl、B2-H1，H2;吸取50L样品溶液于其余微孔中。7.3.3 分别吸取100L酶标记物溶液于每一个微孔。7.3.4 用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式棍匀，室温(20.C-25 .C)避光孵育10min。7.3.5 倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥，然后立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件
8、进行洗板。7.3.6 迅速加入100L底物溶液于每一个微孔，然后持微孔板在台面上以圆周运动方式混句后，于室温(20.C -25 -C)避光孵育10min。7.3.7 加入100L反应终止液于每一个微孔，混匀后将微孔架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度(应在加入反应终止液30min内读取吸光度)。2 1 ) 绘出该信息是为了方便本标准的使用者.并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。-3 SN/T 2215-2008 7.4 平行试验按以上步骤，对同一标准溶坡、同样品溶液均应进行平行试验测定。7.5 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。7.6
9、 质撞试验每次测定均应做一个用空白样品添加混合标准(5.5.3)的质控样品测定，以确定检测过程的准确性，添加浓度为相应产品的检测低限。8 结果计算和判定8. 1 结果计算标准品和待测样品的00平均值除以零标准(B1、B2)的平均00值，再乘以100。计算出各际准液和样品的百分比吸光度值，零标准为100%(最大百分比吸光度值)。以吸光度百分比值为纵坐标%)，氯丙嚓标准溶液浓度(ng/mL)对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到样品中相应的残留物浓度后，结果按式(1)进行计算2x = c X V X 1 000 -m X 1 000 ) -A ( . . . . . . . . .
10、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 式中:X 样品中相应残留物的量，单位为微克每千克(g/kg); c 从标准工作曲线上得到的样品中残留物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mU;V一一样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL);m一一样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克(g)0 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。8.2 结果判定结果大于等于O.5g/kg为阳性样品，结果小于O.5g/kg为阴性样品。9 确证试验如被测样品中残留物的值大于测定低限时，应用其他方法进行确证。10 本方法测定低限和回收率10. 1 方法测定低
11、限氯丙嗦、乙酷丙嚓、丙酷丙嗦、丙嚓和三氟丙嗦为:0.5g/kg。10.2 回收率回收率见表1。表1添加琅度及回收率数据(n= 15) 回收率1%药物名称添加浓度1问Ikg): 猪肉虾仁猪肝猪肾牛奶O. 5 6482 6486 6082 6288 6484 氯丙喋10 6080 6683 6280 5782 6282 50 6380 6381 6384 6177 6077 O. 5 6284 6882 6884 6894 6084 乙酸丙曦10 6683 6279 6085 6277 6079 50 6681 6382 6086 6581 62-77 SN/T 2215一2008表1(续)回收率
12、/%药物名称|添加浓度八g/kg)猪肉虾仁猪肝猪肾牛奶0.5 6484 6086 6486 6690 6486 丙酷丙嗦10 6280 6380 6186 6378 6082 50 6282 6281 6482 6282 6693 O. 5 6485 6385 6385 6385 6277 丙嗦10 6484 6585 6585 6785 6677 50 6486 6787 6484 6586 6281 一一0.5 6884 6884 三氟丙嗦10 6377 6079 50 6681 6278 4 SN/T 2215-2008 附录A(资料性附录酣噎曦检测试荆盒(杭州埠恩科技有限公司产晶)1)
13、A.1 试荆盒组成A. 1. 1 预包被抗体的96孔板:12条X8孔。A.1.2 氯丙嗦标准榕被:100 ng/mL使用前以样品稀释缓冲液稀释到O.05、O.1、O.2、0.3、O.6、1.25 和2.5ng/mL。A. 1.3 样品稀释缓冲液的浓缩A. 1.4 酶标物冻干粉:根据试A. 1.5 酶标物稀释液。A. 1.6 A. 1.7 A.1.8 A.2 标准校正曲线标准校正曲线见图A.l。1草、0. 8 0. 7 0. 6 O. 5 逻0.4吨O. 3 。.2。l0 0. 01 y=-O. 169 4In(.r) + O. 1687 R =0. 980 8 固A.1标准校正曲线10 1) 给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。5
