1、5 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2217-2008 进出口动物源性食品中巴比妥类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱法Determination of barbiturates residues in foodstuffs of animal origin for import and export-HPLC-MS/MS method 2008-11-18发布2009-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前言木标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 2217-2008 本标准由中华人民共和
2、国湖南出入境检验检疫局、中华人民共和国岳阳出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局和中华人民共和国山东出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:王美玲、戴华、张莹、李拥军、颜鸿飞、王鹏、林黎明、曹克、黄志强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 2217-2008 进出口动物源性食品中巴比妥类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱法1 范围本标准规定了动物源性食品中巴比妥、苯巴比妥、仲丁比妥、异戊巴比妥、戊巴比妥、司可比妥残留量的高效液相色谱质谱/质谱检测本标准适用于猪肉、鸡肉、鱼肉.、异戊巴比妥、戊巴比妥、司可比妥残留量的测定。2 方法提要3 试剂和材料除另
3、有规定外，所有试剂均为3. 1 乙睛:高效液相色i普级。3.2 甲醇:高效准相色谱级。3.3 己酸接:优级纯。3.4 冰乙酸:优级纯。3. 5 正己屁:优级纯。3.6 乙酸乙醋。3. 7 乙睛饱和的正己:民，00mJ. ，静置分层，取上层被体。3.8 无水硫酸例，650.C灼烧4h 3.9 乙酸钱缓冲液，0.1mol/L , p 并定容至1000 rnL，以冰乙酸调节pH到5.0。3. 10 0.1%乙酸乙腊溶液:准确吸取3. 11 淋洗液1，乙酸债缓冲液(3.的甲3.12 淋洗液ll，正己:境乙酸乙醋(95+5，体积比)。3.13 洗脱液:正己;皖乙酸乙醋(50+50，体积比)。3.14 固
4、相萃取小柱，6口lL/200mg ,Oa;is HLB或相当者。3.15 标准物质:巴比妥、苯巴比妥、仲丁比妥、异戊巴比妥、戊巴比妥、司可比妥均为1.0 mg/mL的甲醇谣液。标准物质信息参见附录A。3.16 混合标准储备液的配置z分别准确移取1.0 mL J单个药物的标准熔液(3.1日子10mL容量瓶中，用甲醇定咨至亥IJ度，配制成浓度为100g/mL的泪合储备液，4.C下避光保存，有效期6个月。3.17 混合标准中间液的配置:用甲醇稀释混合标准储备被至终浓度约为100ng/ mL. 3.18 同位素内标溶液，D戊巴比妥，00g/mL的甲醇溶液。标准物质信息参见附录A。3.19 同位素内标中
5、间液的配置s用甲醇稀释同位素内标溶液(3.18)至最终浓度为100ng/ mL. 3.20 标准工作溶液的配置:根据需要，临用时眼取一定量的混合标准中间液(3.17)和同位素内标中间 SN/T 2217一2008液(3.19)，用甲醇稀释配成适当浓度的混合标准工作溶液。4 试样制备与保存4.1 试样制备从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，充分绞碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，标明标记。在制样的操作过程中，应防止样品受到河染或发生残留物含量的变化。4. 2 试样保存将试样于-18C保存。5 仪器和设备5.1 高效液相色谱-质谱/质谱仪:配电喷算离子掘(ESI)。5
6、.2 组织捣碎机。5. 3 超声波清洗器。5.4 涡旋泪匀器。5.5 离心机(最大转速10000r/min)。5.6 固相萃取装置。5. 7 氮气吹干仪。5.8 pH汁。5. 9 电子天平:感量为0.01g , 6 测定步骤6. 1 提取称取2g(精确至0.01g)经捣碎样品于50mL塑料离心管中，加入适量无水硫酸制(3.的，吸去样品中的水分，加入40L内标j窑液(3.19)，于1昆匀器上?昆匀，再加入10mL酸性乙腊溶液(3.10)，涡旋混合3min，然后置于超声波清洗器中坦声10min。以4000 rnm离心2min.取上层清被于另一50 mL离心管中，残渣再加入10mL酸性乙睛搭液(3.
7、10).重复提取一次，合并上清准。在提取液中力Il入5mL乙脯饱和的正己;庭，涡旋混合，离心，弃去上层正己烧，下层乙腊在氯气吹千仪上45c下吹干。用5mL淋洗液1(3. 11)充分溶解残渣，准备过桂净化。6. 2 净化将OasisHLB固相萃取小柱连接到固相萃取装置，先后用5mL甲醇和5mL乙酸锻缓冲液(3.9) 预淋洗，把上述提取液上柱，控制流速为0.5mL/min，用5时，淋洗液1(3.11)洗涤柱子，并彻底抽干。随后用5时，正己烧和5时，淋洗液日0.12)淋说，最后用10mL洗脱液(3.13)洗脱。并将洗脱液在45C下用氮气吹干。用1.0 mL甲醇溶解残渣，过0.45m做孔滤膜后，供高效
8、液相色谐-质谱/质谱仪测定。6.3 测定6.3. 1 液相色谱条件a ) 巳i昔柱:柱填料为十八;皖基硅;境键合相的色谐柱，150mm X 4. 6 mm(内径)，粒度5m或相当者;b) 流动相2梯度洗脱程序见表1; c) 流速:0.5mL/ min; d) 柱温:35C ; e) 进样量:20L.2 SN/T 2217-2008 表1流动相梯度洗脱程序时间/min0.1%乙酸水溶液/%乙腊/%0.00 90 10 5.00 40 60 8.00 10 90 10. 00 10 90 10. 01 90 10 17.00 90 10 6.3.2 质i营条件a) 离子源:电喷雾离子源;b) 扫描
9、方式:负离子;c) 检测方式:多反应监测(MRM); d) 算化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氯气:使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录B;e) 喷雾电压、去集旗电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度，参二号条件参见附录B.6.3.3 液相色i曾-质i曾/质i昔测定按照上述检测条件测定样液和混合标准工作溶悔。以色谱峰面积按内标法定量。样被中被测物的响应值应在仪器线性范罔之内，如果超出仪器线性范围，应进行适当稀释。在上述色谱条件下待测物的参考保留时间分别7.8min(巴比妥)、9.0min(苯巴比妥)、9.1min(仲丁比妥)、9.8minCD5-J.戈巴比
10、妥)、9.9min(异戊巴比妥)、9.9minC戊巴比妥)、10.3mill(司可比妥)。标准洛液的液相色谱-质谱/质谱色谱图参见附录C中的图C.1。6.3.4 阳性样晶的确证在相同的实验条件下，样液中破测物的质量色谱峰保留时间与标准工作液相同，并且在扣除背景后的样浓谱图中，所选择的离子对均出现，各定性离子的相对丰度与标准品离子的对丰度相比，误差不起过表2规定的范围内，则可判断样晶中存在对应的被测物。表2定性确证时中目对离子丰度的最大允许误差3 相对离子丰度(基峰)/%相对离子丰度虽大允许误差1%50 士202050 士251020 士30:;( 1 0 士506.4 空白试验除不加试样外，均
11、按上述测定步骤进行。6.5 结果计算和表述用色谱数据处理机或按照式(1)计算样品中待测药物的残留量，计算结果需扣除空白。V一-z 一斤!: up-A-h -a 一A一-A E一L -r -rh rt-工. ( 1 ) 式中zz一-j式样中待测药物的含量，单位为微克每千克(g/kg); A 样液中药物的峰面积;C一一标准工作陆中药物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); 11 SN/T 2217一2008Csi一一标准工作搭液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); Ci一一样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); As -标准工作液中药物的峰面积;Ai -标准工作液中内标
12、物的峰面积EAi -样液中内标物的峰面积;V一-样液最终定容体积，单位为毫升(mL); m一一最终样液所代表的试样质量，单位为克(g)。7 测定低阳、回收率7. 1 测定低限本方法测定低限为:1. 0g/kgo 7. 2 回收率回收率数据见表3-表60药物名称1. 0 巴比妥2. 0 5.0 1. 0 苯巴比妥仲T比妥药物名称|添加浓度/(R/巴比妥2.0 I 86.4 - 99 .1 5.0 84.5-95.2 1. 0 83.3-95.6 苯巴比妥2. 0 82.4-92. 2 5. 0 94.9-103.。1. 0 89 . 2-92.8 仲丁比妥2.0 88. 6- 99. 5 5.0
13、 92.4-100.。4 添加浓度/(g/kg)1. 0 2. 0 5. 0 1. 0 2. 0 5. 0 1. 0 2.0 5. 0 |添加浓度!(g/kg)1. 0 . 异戊巴比妥2.0 5. 0 1. 0 戊巴比妥2.0 5.0 1. 0 司可比妥2.0 5.0 回收率/%87. 1 94. 3 85. 0- 10 1. 2 93.1105.6 86 .4- 92.3 90.5- 10 1. 2 甘0.7I03.189. 994. 1 90. O 104.。79 . 397. 6 回收率/%85.0-94. 5 94.8-112.。85.7- 106.4 88 . 5 96. 3 89.
14、7- 102.2 88.1 -97.2 85.5-94. 0 85 .2-92. 5 89. 5 100. 1 SNjT 2217-2008 表5鱼肉中添加浓水平及回收率鼓据药物名称|添加浓度/(闯/kg)回收率/%药物名称添加浓度/(g/kg)回收率/%1. 0 78. 586.。1. 0 89.395.4 巳比妥2. 0 85. 696. 4 异戊巴比妥2.0 89.3-96.6 G. 0 86.7-9G.7 G.O 92. 8 105.。1. 0 86. 793. 4 1. 0 89.4-97.8 苯巴比妥2. 0 92. 4 101.。戊巴比妥2.0 90.2-96.4 5. 0 93
15、. 5 108.。5.0 98. 6 104.9 1. 0 88.5-97.6 1. 0 88.4-96.8 仲丁比妥2. 0 2.0 92. 2 100.2 5. 0 5.0 86.0-100.。药物名称回收率/%1. 0 1. 0 84.6-91. 5 巴比妥2.0 2.0 86.0-92.2 5. 0 5.0 93.4-106.。1. 0 1. 0 86. 9-9G. 1 苯巴比妥2. 0 2.0 91. 5-102.2 5. 0 5.0 90.6-107.2 1. 0 1. 0 78.6-93.3 仲丁比妥2. 0 2.0 84. 9-95. 5 5. 0 5.0 93.8-110.。
16、5 SNjT 2217-2008 附录A(资料性附录)标准物质的基本信息表A.l标准物质基本信息英文名称中文名称CAS号结构式分子式相对分子质量H 。:平。barbital 巴比妥57-44-3 C8 HI2 N203 184 .2 C211 C2H./ Y H 。H phenobarbital 苯巴比妥50-06-6 zi于:ClzHI2N203 232. 24 butabarbital 仲丁比妥125-40-6 EJF CI IJ HI GN203 2 12.25 anlObarbital 异戊巴比妥G 7 -43-2 CH;川C11 H1SN2()3 226.27 (CH31,CHC H
17、 。平。pentobarbital 戊巴比妥76-74-4 C2 H5 C11 H I8 N203 226.27 CH3CH zCH2CH/ Y H CH3 0 H secobarbital 司可比妥76-73-3 四=CHCH口CI 2H1 8 N203 238.25 。H ;平。pen to barbi tal-D5 D-戊巳比妥52944-66-8 CD3一CC1l H1J 03 NZ03 23 1. 24 CH3CH2CH2、H3 6 国SN/T 2217-2008 附录B(资料性附录)API 4000 LC-MS/MS系统检测巴比妥类药物参考条件1)API 4000 LC-MS/MS
18、系统电喷雾离子师、参考条件a) 气帘气(CUR):137. 9 kPa(20 psj); b) 雾化气(GSl):275.8kPa(40 psj); c) 辅助加热气(GS2):344.75 kPa(50 psj); d) 碰撞气(CAD):48.265 kPa(7 psi); e) 电喷雾电压(1曰:一3500V; f) 离子源温度(TEM):500C; g) 定性离子对、定量离子对、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)、碰撞室人口电压(EP)和碰撞室出口电压(CXP)见表B.1所示。表8.1巴比妥类药物的定性离子对、定量离子对、碰撞电ff(CE)、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)和碰
19、撞室出口电压(CXP)待测物Q1 Q3 去簇电压碰撞电压碰撞室入室电压碰撞室出室电压m/z m/Z DP/V CE/V EP/V CXP/V 42. -46 -36 10 -6 巴比妥183.2 140. 4 46 一17-6 一942. 1 -46 42 -9 -6 苯巴比妥23 1. 0 85. 1 一46-18 -9 一14168.2 一46一1811 14 仲丁比妥21 1. 2 42. 1 38 -38 10 -6 182.2 48 17 10 11 异戊巴比妥225.2 42. 1 -48 -42 一10一7182.2 -58 一189 -11 戊巴比妥225. 2 42.1 -5
20、8 -42 -9 -6 194.3 -58 一17一10一11可可比妥2.37. 1 42. 1 -54 44 一106 187. 3 50 -22 6 一18D二-戊巴比妥230. 2 42. 1 50 42 -9 -6 a为定jJ离子对。1 ) 非商业性声明:附录日所列参数是在AP14000质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。7 SNjT 2217一2008附录(资料性附录)巴比妥药物的多反应监测(MRM)色谱圈C 7. 79 7. 巴比妥183.2 42. 1 仲丁比妥21 1. 2 42. 1 23 1.
21、 0 42. 1 14 苯巴比妥12 8. 96 9.13 d) 巴比妥183. 2 140. 4 8. 97 9.12 c) 2 AAU AUVAU ZUAU 何，unLA-a的也ECZE-z-970 quqd。zeqhutA-AaubzzE-800 600 400 2 。aubEEEE-o e ) 。5-1戈巴比妥230.2 42.1 9. 79 5000 187.3 9. 79 30 25 20 、言1500 E 吉1000 1000 16 14 12 8 10 I j mm 6 4 。2 500 。 ) LH 巴比妥药物的多反应监测(MRM)色谱圈圆C.1自)8 SN/2217-200
22、8 9.87 9.87 1.20e 1.00.: 异.llt比妥异戊比妥- 8000.00 225.2 182. 2 225. 2 42. 1 i、5az b 、飞6000.00 4000.00 5000. 0 2000.0 0.0 2 4 6 8 10 12 14 16 2 4 6 8 10 121在16 Il m;n 1I1阳的i) j) 9.87 9.84 120 e 喜川i戊巴比妥225. 242.1 6000. 00 4000.00 2000. 00 17 0.00 4 6 6 8 10 f加mk) , ) 10.24 1. 20e ;82斗司可比妥60， 237. 1 42.1 4000. 。L，、m2 4 6 m ) n) 9
