1、ICS 11. 140.01 C 30 中华人民共和国医药行业标准YY /T 0616-2007 一次性使用医用手套生物学评价要求与试验Medical gloves for single use Requirements and testing for biological evaluation (EN 455-3: 2000 , MOD) 2007-07-02发布2008-03-01实施国家食品药品监督管理局发布YY /T 0616-2007 目次前言.1 引言. 11 l 范围-2 规范性引用文件-3 术语和定义4 要求.2 5 试验方法.2 6 试验报告.3 附录A(规范性附录)用改良L
2、owry分析法测定天然橡胶手套水需性蛋白质的方法.4 附录B(资料性附录)医用手套可需出蛋白质和过敏原的免疫学测定方法.10 附录C(资料性附录)高效液相色谱法(HPLC)测定氨基酸(AAA).12 附录D(资料性附录)术语.16 参考文献.17 VY/T 0616-2007 前士一同本标准修改采用EN455-3: 2000(一次性使用医用于套第3部分:生物学评价要求与试验)，与EN 455-3 :2000无技术性差异，仅将引用的欧洲标准和药典改为我国相应标准和药典。本标准的附录A是规范性附录，附录B、附录C和附录D均为资料性附录。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会提出并归口。本标
3、准起草单位:山东省医疗器械产品质量检验中心。本标准主要起草人z秦冬立、黄经春、由少华、吴平。I YY /T 0616-2007 引最近儿年，常有报道胶乳产品由于含有胶乳蛋白质使医护人员和病人产生不良反应，由于化学物质、润滑剂、灭菌残留物(环氧乙皖)、致热物等残留物产生的不良反应也在科学文献中有所描述。其中报道最多的是天然橡胶胶乳手套产生不良反应，但其他聚合物制成的手套也可以引起一些不良反应。GB/T 16886标准给出了有关医疗器械生物学评价指南，并包括了特定试验和其他涉及安全性规范的试验方案。本标准未涉及使用医用手套所产生的全部不良反应(如速发型超敏反应)，存在于手套中的特异性过敏原会引发这
4、些不良反应，导致这些反应的因素有:a) 长期、高频次佩带手套pb) 皮肤与蒙古膜直接与过敏原(又称变应原接触，特别在皮肤与蒙古膜有损伤的情况下接触过敏原或吸入微粒;c) 常年使用手套，手套紧密贴敷皮肤。本标准给出了用以评价医用于套生物学安全性的试验方法，作为YY/T0316风险管理过程的一部分。本标准没有规定胶乳蛋白质和化学物质的可接受水平，因为在这一领域有关安全性评价因素(如过敏原的识别、致敏作用闹和过程控制等)尚不十分清楚。随着对其认知的不断提高，预期本标准将会被修订。目前进一步测定和控制这些过敏原的试验方法还处于研究之中。E 1 范围一次性使用医用手套生物学评价要求与试验YY /T 06
5、16-2007 本标准规定了一次性使用医用手套生物学安全性评价的要求，给出了标示和手套包装的要求以及所用试验方法的信息。本标准还包括用于可蓓出蛋白质和过敏原测定的免疫学试验方法综述。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分z评价与试验(GB/T16886. 1-2001, ISO 10993-1: 1997 ,I
6、DT) GB/T 16886.5 医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验(GB/T16886. 5-2003, ISO 10993-5: 1999 , IDT) GB/T 16886. 7 医疗器械生物学评价第7部分z环氧乙皖灭菌残留量(GB/T16886.7一2001，ISO 10993-7 :1 995 ,IDT) GB/T 16886. 10医疗器械生物学评价第10部分:剌激与迟发型超敏反应试验(GB/T16886. 125， ISO 10993-10:2002,IDT) GB/T 16886. 12 医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品(GB/T16886. 12-2
7、5， ISO 10993-12:2002 ,IDT) YY/T 0316 医疗器械风险管理对医疗器械的应用(YY/T0316-2003 , ISO 14971-1:2000, IDT) 中华人民共和国药典二部(2005年版3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 化学物质chemicals 生产过程的任何工序中或贮存期间添加或形成的物质，包括润滑剂、化学涂层和灭菌剂，这些物质可从最终产品中检出。3.2 内毒素endotoxins 来源于革兰氏阴性菌细胞膜外层结构的脂多糖。注2内毒素来源于原材料、生产过程中的工艺用水和手工处置过程中的细菌污染。3.3 可溶出蛋白质leachable p
8、roteins 从最终产品中溶出的不同分子量的水溶性蛋白质和肤。注:蛋白质主要来源于天然橡胶胶乳。蛋白质和其他可能添加的蛋白质会在生产过程中发生变性和降解，水中浸提出的蛋白质可引起I型过敏反应。1 YY/T 0616-2007 3.4 热原pyr吨ens使家兔发热的物质，这些物质也能使人体产生发热反应和其他不良反应。注:内毒素是热原的一种。3. 5 过程限值pr侃臼sJimit 生产过程中可能产生的最高蛋白质含量。4 要求4. 1 总则一次性使用医用手套应4.2 可溶出蛋白质4.3 内毒素示的手套，每副手4.4 化学物质手套应不含在的化学成分，如4.5 标示除了其他相a) 白天然橡b) 注意:
9、手术!.!.注:该注意事项c) 制造商如标示注1:不允许标示蛋注2:尚未确定对胶乳d) 不应标示低变应原剧，5 试验方法5. 1 可溶出蛋白质测定可溶出蛋白质的方法应采用附录A给出的改良Lowry法，或经与改良Lowry法比对确认过的方法，详见附录A。注1:现有确认过的用于可溶出蛋白质分析的其他方法(如附录C给出的确认过的氨基酸分析法).只要能证明这些方法经过确认，并与本标准规定的标准方法有对应关系就允许采用，但这些方法不适合用于常规质量控制。注2:蛋白质免疫学测定法还处在发展过程中参见附录B).5.2 内毒素除非堂试剂(LAL)试验中出现无法排除的干扰现象，对方法的选择、确认和使用应符合中华
10、人民共和国药典)(以下简称中国药典)规定的细菌内毒素检查法或具有相同灵敏度和重现性的LAL试YY/T 0616-2007 验方法。LAL试验中如出现无法排除的干扰，不能准确测出细菌内毒素水平，这种情况下可以采用中国药典中规定的兔热原试验。LAL试验结果应表示为每副手套含内毒素单位(EU)。每批产品都应进行试验。推荐的手套最小检验量根据批量确定。批量少于30副时，取样量为两百;批量在30副100副之间时，取样量为3副z批量超过100副时，取样量为3%.但最大取样量为10副。每副手套的外表面用40mL无内毒素水(中国药典中规定的细菌内毒素检查用水)在37C 40C下浸提40min60 min.浸提
11、过程中要保证手套的整个外表面与浸提介质接触。必要时将浸提液以2000g离心15min.以除去微粒。离心后取出浸提液立即进行内毒素试验。注=其他现有公认的内毒素分析方法，只要经过确认并与本标准所规定的方法具有相关性，也可用来进行常规质量控制。6 试验报告试验报告至少应包括下列信息:一-一本标准编号p一一一手套类型和生产批号;一一-制造商或供应商和试验室如果不同)名称和地址s-一一试验日期F一一所用试验方法的描述F一一试验结果。3 YY /T 0616- 2007 附录A规范性附录)用改良Lowry分析法测定天然橡胶手套水溶性蛋白质的方法A.1 范围误差，则可以采用任何经确汉温撞罐磊辜酸分析方法(
12、如附录C给出国A.2 原理有E，理削栅基蛋白是性同理溶何原水质的物析性分A.3 试剂A. 3. 2. 1 N-三(搓注:英文名称为N-tiS!A. 3. 2.2 浸提缓冲液注z制备足量的手套浸提A. 3.2. 3 染色液，澳盼蓝、蛋白质标准液CA.6. 3. 2)和空白液。用水溶解100mg澳酷蓝A. 3. 3. 2 试剂B，稀释的Folin试剂。A. 3. 4 氢氧化锅溶液，c(NaOH)=0.1 mol/L。A. 3. 5 脱氧胆酸销(DOC)，用水溶解0.15g脱氧胆酸铀并稀释至100mL。溶液制备后保存4周。A. 3. 6 三氯乙酸(TCA), 4. 4 mmol/L水溶液，用水擦解7
13、2gTCA并稀释成100mL即得。溶液制备后保存4周。A. 3. 7 磷鸽酸(PTA)，用水溶解72g PTA并稀释至100mL。溶液制备后保存4周。1) Lowry Micro DC蛋白质成套分析试剂(分类号为500-0116)可从BioRad实验室购得，地点:2000 Alfred Nobel Drive. Hercules, CA9456547, USA。这一信息仅为本标准的使用者提供便利.并不意味着CEN对这一产品的认可。4 A.3.8 卵清蛋白，从冻干的鸡蛋幻中提取，元盐。A.4 仪器A. 4.1 合成手套，元粉。A.4.2 离心机，离心力至少可达到6000 g 0 YY/T 061
14、6-2007 A.4.3 离心试管，30mL或50mL聚丙烯试管，试管的蛋白质吸附量每管不超过10阅，不要使用玻璃器具，因其表面吸附蛋白质。注z第A.5章给出了一种测定蛋白质吸附量的方法。A.4.4 滤膜，一次性使用，孔径为0.22m，每个滤膜的蛋白质吸附量不超过10问。注g第A.5章给出了一种测定蛋白质吸附量的方法。A.4.5 注射器，一次性使用，20mL，用聚乙烯或聚丙烯材料制造。A.4.6 微型试管，2mL，用聚丙烯材料制造。A.4.7 石英比色池，1cmo A.4.8 酶标板，96孔，平底，用聚苯乙烯材料制造，或一次性板池CA.4.的。A.4.9 一次性板池，1.5 mL半微型，1cm
15、，用聚苯乙烯材料制造。A. 4.10 酶标仪，波长范围600nm-750 nmo A. 4. 11 分光光度计，波长范围230nm-750 nm。A. 4.12 涡旋式混合器。A. 4.13 微量移液器，带有一次性聚丙烯吸头。A. 4.14 夹具，用于浸提过程中密封手套防止漏水。推荐使用衬有泡沫橡胶可旋紧的铝质夹具(见图A.l)，或170mm长的血液透析塑料夹具。1 3 2 4 1一外手套z2 内手套z3一一浸提缓冲液54一一-染色溶液g5一一手套夹具。20n 20n A B 圈A.1孚套漫提2)该卵清蛋白是用鲜鸡蛋白通过在pH4.5下用硫酸镀分馆和反复结晶制得。如SigmaA5503、鸡蛋白
16、，V级，可从Sigmar Chemical Co. P. O. Box 14506 ,St Louis , M063178 , USA购得。这一信息仅为本标准的使用者提供便利，并不意味着CEN对这一产品的认可。5 YY/T 0616-2007 . 4.15 振荡器。.5 蛋白质服附量测定. 5.1 总则推荐使用一次性聚丙烯器具(聚丙烯被认为具有低蛋白质结合力)。在使用一批新的离心试管或过滤装置以前，应使用下列方法检查其蛋白质结合力。试验应在1d之内进行。.5.2 离心试管的蛋白质服附量. 5. 2.1 在离心试管CA.4. 3)中加30mL含10g/mL卵清蛋白的标准溶液，标准溶液的配制方法是
17、用浸提缓冲液(A.3.2.2)稀释蛋白质储备液(A.6. 3. 1)。. 5. 2.2 移取10mL卵清蛋白搭液(A.5. 2.1)至新的离心试管中，在振荡器(A.4.1日上振荡。确保试管所有表面被搭液浸润，30min后再将此管溶液移至另外一个试管中振荡。以此步骤浸润5支试管后收集剩余试验液。同法操作平行管。.5.2.3 用A.6. 4-A. 6. 6所给方法分别测定标准禧液和两份试验液中蛋白质浓度，各测量三次。. 5. 2. 4 按式(A.1)计算每管卵清蛋白平均吸附量:式中:。=10(R - T)/5 = 2(R- T) 。一一吸附的卵清蛋白量，单位为微克(g);R一一标准溶液卵清蛋白含量
18、三次测量的平均值;T一一试验液卵清蛋白含量的平均值(即六个测量值的平均值)。每管吸附的卵清蛋白量(0)应小于10/Lgo否则，这些试管不适合用于测量。.5.3 过滤装置的蛋白眼附量测定.( A. 1) . 5. 3.1 在离心试管(A.4. 3)中加30mL含10g/mL卵清蛋白的标准榕液，标准榕液的配制方法是用浸提缓冲液(A.3. 2. 2)稀释蛋白质储备液(A.6. 3. 1)。. 5. 3. 2 准备两叠滤膜(A.4.的，每叠五张，每叠过滤10mL标准溶液至一离心试管中(A.4. 3)。. 5. 3. 3 用A.6. 4-A. 6. 6所给方法分别测定标准溶液和两份试验液中蛋白质浓度，各
19、测量三次。.5.3.4 按式(A.2)计算每管卵清蛋白平均吸附量:式中z。=10(R- T)/5 =2(R-T) O一吸附的卵清蛋白量，单位为微克(g);R一一标准搭液卵清蛋白含量三次测量的平均值;T一一试验液卵清蛋白含量的平均值(即六个测量值的平均值)。每滤膜吸附的卵清蛋白量(0)应小于10阅。否则，这些滤膜不适合用于测量。.(A. 2) .6 步骤. 6.1 总则步骤包括了手套浸提、然后以系数5对浸提液浓缩，使其纯化。用同法浓缩的蛋白标准液制作校准曲线，依据校准曲线测定浸提液中蛋白质含量。取两只手套，同时浸提一只的内部和另一只的外部。这可使浸提体积最小至25mL，且由于浸提缓冲液只与手套接
20、触，避免了与容器表面接触所引起的蛋白质损失。6 注2其他浸提步骤只要参比本方法经过确认也可以使用。在欧洲和美国与所选定的一些实验室中所进行的实验室间的比对试验表明，按ASTMD 5712标准把手套剪成碎片再在pH值为7.4的TES缓冲液中25C下浸提2h 的测定结果与本法相当。YY/T 0616-2007 A.6.2 漫提步骤A. 6. 2.1 戴合成手套(A.4. 1)操作手套样品。取8只同规格、同批手套样品，并分成4对。若手套是分左右手的，则择选4只右手样品、4只左手样品，分成两对右手和两对左手。先在每对于套中选一只自中指尖向腕部取20cm处做一标记，称量(ml).精确到0.1g。再将另一
21、只手套插人到做了标记的手套内，使其完全吻合，如图A.1所示。注z将一只手套插入另一只的方法对试验并不十分重要，但其操作要尽可能简化。为此可以先向内手套的拇指和小拇指插入一圆捧帮助将其插入外手套的相应的手指内，同样用圆棒将其他三个指插入。A.6.2.2 将足量的染色液(A.3. 2. 3)充满内手套的五个手指内。在内外手套之间注人温度为(25士5).C的浸提缓冲液(A.3.2.2)。对于规格较大的手套，加人的缓冲液体积可增加至50mL。排出大多数空气泡，并按图A.1所示用夹具(A.4.14)在20cm标记处密封，以防止液体漏出。A. 6. 2. 3 将手套置于振荡器(A.4. 15)上于(25士
22、5)c下振荡(120士5)min。A.6.2.4 取下夹具，仔细分开手套。注意不要使染色液污染浸提液，如果浸提液呈蓝色，应弃之用新手套重新浸提。A.6.2.5 将浸提液移人离心试管(A.4. 3)中，不低于2000 g离心15min.或用一次性使用滤膜CA. 4. 4)过滤，也可两种方法并用，使之澄清。制得的清澈液可在2C8C下冷藏并在48h内测定，也可在-18.C以下冷冻，不超过两个月内测定。A. 6. 2. 6 从浸提过的外手套20cm标记以上的腕部切下，用吸水纸擦去表面液体，室温下晾干，称量(m2) 精确到0.1g.按式(A.3)计算该手套浸提部分的质量:m = ml -m2 ( A.
23、3 ) A.6.3 蛋白质标准液A. 6. 3.1 蛋白质储备渡将25mg卵清蛋白溶解于25mL浸提缓冲液(A.3. 2. 2).制备标称浓度为1mg/mL卵清蛋白搭液。用0.22m滤膜(A.4. 4)过滤，用uv分光光度计在280nm处用石英池(A.4. 7)测定吸光度，计算实际卵清蛋白浓度。吸光度除以0.7153)即是实际的浓度值(mg/mL)。该溶液在冷藏条件下可稳定2 d.在一18.C以下冷冻可稳定两个月。解冻需在45C下加热15min。A.6.3.2 蛋白质标准液用浸提缓冲液(A.3. 2. 2)稀释储备液制成系列标准液。使溶液被度约为100g/mL、50g/mL、20g/mL、10
24、g/mL、5g/mL和2g/mL。用浸提缓冲液作空白。这些溶液在冷藏条件下可稳定2d. 在一18C以下冷冻可稳定两个月。解冻需在45C下加热15min. A.6.4 蛋白质的沉淀与浓缩A. 6. 4.1 在(25士5)c下做平行试验。A.6.4.2 精确移取空白液、蛋白质标准液(A.6. 3. 2)和三个手套的浸提液(A.6.2.5)各1mL至微型试管(A.4. 6)中。加0.1mL DOC(A. 3.日，涡旋混合后放置10min.加0.1mL TCA(A. 3. 6)和0.1 mL PTA(A. 3. 7).涡旋混合后放置30min。A.6.4.3 在6000g下离心15min。倒出上清液，
25、并将各试管倒置于吸水纸上5min。A. 6.4.4 向包括空白在内的各试管中加0.1mol/L的氢氧化铀溶液(A.3.的0.2mL。在涡旋混合器上混合使沉淀出的蛋白质榕解。确保使蛋白质完全溶解成清澈液。有些手套有时需在(5士3)c下过夜冷藏。如果仍有沉淀物，以0.20mL为单位，逐步加入标定过的氢氧化销榕液，最多至总量为1mL.以后步骤均用0.2mL的整数倍。沉淀前稀释这种样品浸提液可能是有效的。3)假定分子量为43000 Da 280 nm和pH7.4下30745的摩尔消光molarextinctoin).l cm比色池下pH7.4的o. 1 mol/L TES缓冲液中1mg/mL卵清蛋白的
26、消光是0.715.7 YY /T 0616-2007 注z将蛋白质沉淀后再溶解的目的是使蛋白质纯化，排除干扰物。这一过程中难免会有一定量的蛋白质损失。本试验假定蛋白质标准液损失与样品浸提液中损失的百分比相同，但尽管如此，宜使损失为最小，因为过量的损失是不能补偿的。A.6.5 显色A. 6. 5.1 本标准所描述的方法是采用市售的用于确认的试剂盒，其他试剂盒或自行制备的试剂可能需要采用不同的体积和培养时间。A.6.5.2 向含有再次榕解的蛋白质溶液和空白微型试管中加0.125mL试剂A(A.3. 3. 1).充分混合。加1mL试剂B(A.3. 3. 2) .加盖。涡旋混合30min.使显色完全。
27、这一阶段会产生沉淀，测量吸光度前离心或滤除沉淀物。A.6.6 测量A. 6. 6. 1 酶标仪移取一定量的溶液(A.6. 5. 2)至酶标板(A.4. 8)的孔中，充满孔，如500L孔中注入490L。在600 nm750 nm规定波长范围内以空白作参比测量吸光度。注z标准液和手套浸提液在显色稳定后1h内进行分析，这样做的结果具有一致性。A.6.6.2 分光光度计移取溶液(A.6. 5. 2)至一次性板池(A.4.的，在600nm760 nm规定波长范围内以空白作参比测量吸光度。注z标准液和手套浸提液在显色稳定后1h内进行分析。这样做的结果具有一致性。A.7 结果表示A. 7.1 计算A. 7.
28、 1. 1 校准曲线法计算平行测量的平均吸收度。如果个值超出均值的20%.重新测量。绘制平均吸光度对应于原蛋白质标准液的实际浓度校准曲线，如图A.2所示。在蛋白质标准液含量为0g/mL100g/mL的范围内校准曲线应为线性。注z在浓缩过程中损失一部分蛋白质，假定浓缩过程中蛋白质标准液损失与样品浸提液中损失的百分比相同。浓度!(glmL)吸光度0.9 t I 2 0.036 5.2 0.099 0.8十|10.4 0.159 20.8 0.291 52.0 0.583 104.0 0.945 军0.6主主5tpn . 0.5 0.4 0.3十./ . 吸光度/ -一一计算机生成的最近似的方程式y
29、=-4E-O. 2+0. 01 3% +0. 024 7 0.1 o . 。20 40 60 80 100 120 固A.2分光光度计用1cm池在750nm下测得的典型标准曲线8 YY /T 0616-2007 . 7.1.2 浸提液浓缩分别计算四份浸提液中两次平行测量的平均值(见A.6. 4.1)。如果个值超出均值的20%，重新测量。从曲线的线性部分直接读出浸提样品中的故度(g/mL)。注z在校准曲线不是线性的情况下，其值可以用回归方程来计算。建议用适用的市售计算机曲线软件计算未知浓度。A.7.2 结果每个样品的蛋白质含量用式(A.。给出zP = VcF/m 式中zP一一可提取蛋白质含量，单
30、位为微克每克(g/g);V一-一所用浸提介质的体积，单位为毫升(mL); c-一浸提液的蛋白质浓度，单位为微克每毫升(g/mL); F一一-稀释系数F注:F是再次溶解蛋白质所用的NaOH溶液的体权(mL)除以0.2。m一一-被浸提手套的质量，单位为克(g)。报告四个手套浸提液测定的平均蛋白质含量。.(A. 4) 9 YY/T 0616-2007 附录B(资料性附录)医用手套可溶出蛋白质和过敏原的免瘟学测定方法B.1 关于天然橡胶肢乳中有临床意义过敏原的当前认识免疫介导的对天然橡胶胶乳的超敏性反应(lgE介导的I型超敏反应)是胶乳制品中洗提出的蛋白质和多肤引发的。两维免疫印迹技术已证实，在新鲜采
31、集的天然橡胶胶乳中有多达240种不同的多肤，其中至少有57种由于能结合胶乳过敏症患者血清中IgE抗体而被确认为过敏原凶。目前已充分证实，天然橡胶胶乳中的几种蛋白质能与IgE结合，并可以引发胶乳过敏症患者免疫介导的超敏反应5，6，7，8，25、叫。最近对其中一部分蛋白质在基本结构水平上进行了定性研究，得出了大部分有意义过敏原的基本结构数据:prohevein20kDa, hevein C区14kDa，橡胶伸长系数CREF)14.6kDa，36kDa蛋白质(大概是一种橡胶树endo-l，3-葡糖昔酶)，以及从未定性过的、表现分子量约为27kDa和45kDa的天然橡胶胶乳蛋白质9，10，11，叫。当
32、前对不同手套浸提出的特异性过敏原的认知甚少，但越来越多的迹象表明，携带抗原决定簇的小分子量的肤可能起关键作用。有多种因素会明显影响溶出蛋白质的总量和性质，这些因素如原材料的处置、加工过程中添加的化学物质和其他物质、制造过程中加工工艺(如合戚、硫化、滤取等)的改变。在考虑具体的免疫学分析方法时，重要的一点是该方法应能区分开过敏原(能结合IgE)和抗原。以下条文简要介绍了测定天然橡胶胶乳特异性过敏原的文献方法。B.2 天然橡胶肢乳过敏原的免在学测定方法B.2.1 定性/半定量方法B. 2. 1. 1 免在印迹技术一维和两维免疫印迹技术是具有较高价值的方法，已从几方面提供了有关具有临床意义的天然橡胶
33、胶乳过敏原的大量重要信息。然而，从这些研究中获取的手套浸提液方面的结果对于实际分析相关过敏原存在与否(更为重要)的研究并没有太大的帮助。尤其应注意的是，用标准的Western印迹技术可能检测不出小分子量的肤，而这些溶出的小分子量肤大部分都具有过敏原活性。B.2. 1. 2 免在斑点这是最近建立的一个半定量方法，用于测定IgE结合过敏原21.22J。将标本置于硝化纤维纸上，加上胶乳过敏症患者的血清，经放射自显影后可检出与IgE结合的过敏原。这种方法虽然简单，但比较耗时，而且对于低过敏原活性的标本来说不够灵敏。像这种在实验室为每一受检标本制备一个固相过敏原的方法，一般很难达到理想的标准化。B.2.
34、 1. 3 火箭免瘟电津(RIE)、火箭盟射免疫电泳(RRVE)、双向免霞电泳(CIE)、双向放射免瘟电旅(CRIE) RIE/RRVE是一维电泳，CIE/CRIE是两维电泳，这些方法使用兔抗胶乳抗体使抗原发生沉淀，经蛋白质染色后可识别，过敏原经IgE测定和放射自显影步骤可被检出叫。为了获取可靠的结果，试验所用的动物(一般采用兔)的抗血清应含有与全部肢乳过敏原相对应的抗体。这些方法也相当耗时，因此仅推荐用于研究目的。B.2.2 定量方法使用标记继发抗体的IgE抗体抑制测定法:在放射性过敏原吸附试验(RAST)抑制测定法中，将过敏原固定在一适宜的固相载体上，用特异性IgE抗体进行识别。在剂量依赖
35、方式下，相同的过敏原或抗原决定簇能抑制参照血清中的IgE抗体的结合。将溶出物系列稀释液测定结果与已知标准品进行比10 YY/T 0616-2007 较，可以对抑制程度进行定量。该测定法的两个重要的先决条件是:固相载体格子内应有全部相关过敏原，且参照血清应含有全部相关特异性IgE抗体。RAST抑制法的一大优点是对过敏原的测定已实现标准化阳，同时该法灵敏性高，试验所需的设备和必要的专业技能方面的要求在许多进行过敏原试验的专业临床实验室中都是可以达到的。RAST抑制试验的主要问题是目前IgE抗体的来源要依赖于人血清，而且该法也被认为耗时、费用较高。在标准酶联免疫吸附试验(ELISA)抑制测定中，将天
36、然橡胶胶乳蛋白固定在酶标板孔的表面，方法原理与RAST抑制法完全相同，而且ELISA抑制测定所用的IgE抗体也来源于人血清。与RAST法比较，ELISA法试验费用低廉，但由于过敏原至圄相载体的非共价粘附，使得ELISA法很难实现精确的标准化。在天然橡胶胶乳致敏性方面，已有多个研究小组采用RAST抑制法测定天然橡胶胶乳制品中的过敏原活性27J。到目前尚无关于RAST抑制法已由NRL刺皮试验(skinprick testing)进行了确认的报道，但从一项尚未公布的RAST抑制法中得出的数据已显示了该法与刺皮试验有显著的相关性。目前尚未见有用确认过的ELISA抑制法来对橡胶制品可溶出过敏原进行定量的
37、报道数据。但在一项参照上述方法进行的未发表的研究中发现，最近发展的ELISA抑制法与刺皮试验和RAST抑制法都有显著的相关性。与皮肤试验相同，IgE抗体抑制试验结果表示了包括各种过敏原的蛋白质(每个浓度是未知的)在内的总含量。一般来讲，用于测定过敏原的免疫测定法还必须用体内试验来予以证实，以确证所测定出的过敏原也能在体内引发变态性反应。B.3 未来展望将来的研究有必要对全部有意义的天然橡胶胶乳过敏原的基本分子结构进行定性分析，并对免疫显性过敏原的抗原决定簇进行测定。在建立可靠的过敏原免疫测定方法并实现标准化之前，这些信息是必需的。在这些研究中，重点应放在对于套浸提出的过敏原分子定性分析方面，实
38、际上目前在这方面知之甚少。有几个实验室正在建立特异性免疫学测定方法，这些方法采用提纯的天然橡胶胶乳过敏原和特异性多克隆或单克隆抗体，以有意义的过敏原决定簇来定性各识别孔。当提纯的天然橡胶胶乳蛋白质和对应的单特异性抗体能够保证其有效性时，这些过敏原特异性测定法在经过适当的确认后，便可作为常规过敏原试验。由于各种过敏原数目估计较多，可能多于20个，这样将有必要进行主要过敏原的筛选。将来最终的目标是，在过敏原特异性免疫测定法中不再需要人血清作为参照抗体的来源。B.4 建议对于验证和测定手套浸提液中天然橡胶胶乳过敏原的具体方法还有待于进行确认并标准化，这些方法的有效性也需要整理和证实。在过去几年期间，
39、很多事例表明，采用适当标准化并确认过的方法测定可需出蛋白质的总量是适宜的临时性过渡方法，在大多数情况下，可对天然橡胶胶乳手套的致敏性给出有效的评估叫。11 YY/T 0616-2007 附录C资料性附录)高效班相色谱法(HPLC)测定氨基酸(AAA)C.l 背景通常蛋白质的测定是基于某些特殊基团的显色反应，这些基团在不同的蛋白质中呈现出不规则分布川其原因是它们与显色剂产生各种反应或阻碍显色e氨基酸分析可避免上述问题，这一结论已被欧洲委员会测定与试验仰8计划的研究结果所证实。在这项研究中，采用氨基酸分析法测量蛋白质的浓度，临床试验数据(pricktest)与化学分析之间呈现出良好的一致性闷。然而
40、，在测定天然橡胶手套中蛋白质含量时，宜采用改良Lowry法作为标准方法。因为氨基酸分析法不常用，将其作为标准方法过于复杂，但可用于对改良Lowry法的结果进行验证。氨基酸分析法虽然不宜作为蛋白质的标准测定方法，但有助于消除制造商在用标准方法测定蛋白质时导致错误测定的物质。C.2 高效擅相色谱法(HPLC)测定蛋白盾的原理将蛋白质在6mol/L盐酸溶液中水解为游离的氨基酸，然后用高效液相色谱CHPLC)叫进行分离并检测。通过一种内标物(正额氨酸)并累加各种氨基酸来定量测定蛋白质总量。这一方法不受任何有机聚合分子结构的影响，且至今未发现任何干扰物质，同时TES盐类的存在还可避免氨基酸的损失如:屏蔽
41、效应)。C.3 蛋白质测定具体步黯C. 3.1 水解取已注入5nmol正孀氨酸的蛋白质样品，其含量在0.4g-lO月之间，在一密闭的聚丙烯管中用6mo1!L盐酸溶液在llOC下水解48h。宜使用所能得到的最高纯度的盐酸，水解前用氮气流将氧气排出。水解后将试样蒸干(例如使用高速真空浓缩器).然后重新需解于衍生缓冲液中。在盐酸水解过程中，各氨基酸的分解速率不同，因此水解必须是在相同条件下同时对每套样品中期望存在的所有氨基酸的等摩尔混合液中进行。C.3.2 桂前衍生因未改变的氨基酸具有不同的光学响应，在检测前须将其转化成可检测的衍生物山。推荐使用常用的。-肤二醒COPA)和3-琉基丙酸CMPA)柱前
42、衍生法，在高效液相色谱柱中将形成的荧光异构巧i喋衍生物分离出来，并通过荧光检测器进行检测。该衍生过程取决于时间和温度，因此宜自动进行(如使用自动制样器)。C. 3. 3 高效液相色谱分离在高效液相色谱分析中推荐使用微机控制的二元高效梯度系统。所有19种氨基酸的分离条件取决于反相柱的材料，这种材料的批间差很大，因此最好使用测试过的专用色谱柱。C.4 计算通过计算氨基酸与内标物质正绸氨酸)之比得出氨基酸浓度，用各氨基酸之和求得蛋白质总含量的浓度。有些手套浸提液中游离氨基酸的量较高，因此有必要进行两次高效液相色谱检测。一次用盐YY /T 0616- 2007 酸水解，另一次不用盐酸水解，水解后的游离
43、氨基酸总量减去未水解的氨基酸总含量，求得胶乳蛋白质的浓度。聚合蛋白质的水解需要向每一肤键加人一分子的水。假设是等分子分布且列出的氨基酸(表C.l)的平均分子量为147，这就会导致在蛋白质浓度检测时有12%的误差。不过，这一误差基本上被色氨酸、脱氨酸和脯氨酸的损失所补偿.使用卵清蛋白的高效液相色谱氨基酸分析法的准确度和精密度见表C.2.表C.1标准溶液图C.1a)J与经水解的手套浸提渡圈C.1b)的渍相氨基酸x标妒叫溶;二飞注释AWdF 天门冬氨酸(ASP)天门冬曹先胶(ASN)谷氨酸(GLU)谷氨酸胶(GLN)丝氨酸(SER)级氮殷(HIS)I:t氨酸(GLY)苏氨酸(THR)精氨酸(ARG)
44、丙氨梭(ALA)异亮氨酸(ILE)直在丙氮梭(PHE)亮氮般(LEU)Ra氨酸(TYR)缴氨酸(VAL)甲硫氨酸(MET)正缀氨酸(NORVAL)赖氨酸(LYS)28. 41 30.65 28.44 30.60 色氨酸(TRY)脱氨酸，半就氨酸(CYS)脯氨酸(PRO)时一些13 YYjT 0616-2007 表C.2280 nm处(蛋白质量大吸收改良Lowry法与AAA(HPLC)法对pH7.4的四S缓冲撞中卵清蛋自的分析结果含量/UV280 nm/ Lowry HPLC 蛋白质(g/mL) (g/mL) g/mL CVC%)I) g/mL CVC%) 卵清蛋白10.0 10.0 10.6
45、8.6 10.1 8.1 卵清蛋白25.0 25.0 25.8 8.3 25.4 6.3 1) CV是连续20天测量的变异系数E 不普及，只有用时较长;400 300 225 对数据进行评估时需YY/T 0616-2007 3 、mh e、3N 唱-;司唱-() cFq 3 . 吧俨15 YY /T 0616-2007 D.1 过敏原aIIergen诱发变态反应的抗原。D.2 抗体antigen附录D(资料性附录术语接触过具有诱发特异性抗原以后，被激活的B细胞和浆细胞所形成的免疫球蛋白。D.3 抗原antigen任何能被带有抗原受体的淋巴细胞所识别的化合物。抗原引起免疫反应或免疫耐受。在T细胞
46、的参与下才能引起免疫反应的抗原为T依顿性抗原，而不需T细胞辅助的抗原为T非依赖性抗原。所有免疫原都是抗原，但抗原未必都是免疫原(见免疫原)。D.4 抗原决定簇antigenicdeterminant 抗原决定簇是存在于抗原表面的一个抗原位点(表位)。表位被T细胞或B细胞上的抗原受体识别(T细胞表位或B细胞表位)。D.5 超敏反应hypersensitivity对剌激物的异常过强的免疫介导反应。D.6 速发型超敏反应(杰尔库姆斯I型反应)immediate type hypersensivity 接触抗原后数分钟至数小时内产生的抗体介导的免疫反应，该反应需要有先期的接触。比如，花粉抗原引起的过敏
47、性鼻炎。D.7 免在原immunogen一种能诱导特异性免疫反应(特异性抗体形成和/或特别是有淋巴细胞参与的物质。为了诱导抗体反应，免疫原必须具有结构和功能上激活B细胞和T细胞的决定簇。D.8 淋巴细胞lymphocyte来源于骨髓的细胞，具有较少的细胞质，能够在循环和组织之间迁移和交换，并能在与抗原接触的部位滞留，也能在这些部位被抑制，是唯一能对抗原进行特异性识别并产生应答的细胞(主要在辅佐细胞的参与下)。淋巴细胞按其功能和产物分为不同的亚群(如B淋巴细胞、辅助性T细胞和细胞毒性T细胞)。D.9 致敏作用sensitization个体与抗原接触诱发特异性免疫记忆。16 YY /T 0616-2007 参考文献lJ YY 0466-2003 医疗器械用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号(lSO15
