1、ICS 11100C 44中华人民 共禾口、国医药行业标准YYT 068812008临床实验室检测和体外诊断系统感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价 第1部分：抗菌剂对感染性疾病相关的快速生长需氧茵的体外活性检测的参考方法Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems-Susceptibility testing of infectious agents and evaluation ofperformance of antimicrobial susceptibility deVicesPart
2、 1：Reference method for testing the in vitro activity ofantimicrobial agents against rapidlygrowing aerobic bacteria involved in infectious diseases2008-IO-17发布(ISO 20776 1：2006，MOD)2010-0101实施国家食品药品监督管理局 发布目 次前言引言1范围2术语及定义3试验程序31概述32培养基33抗菌剂-34接种菌液的制各t，35微量稀释盘的接种-36微量稀释盘的孵育37结果的判读 -38 MIC结果可能不能反映抗菌
3、剂真实活性的特殊情况及其处理4质量控制附录A(规范性附录)对于Mueller Hinton肉汤的要求参考文献YYT 068812008，00000加如加U地坞刖 昂YYT 068812008YYT 0688的本部分修改采用ISO 207761：2006临床实验室检测和体外诊断系统感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价第1部分：抗菌剂对感染性疾病相关的快速生长需氧菌的体外活性检测的参考方法。本部分与ISO 20776一l：2006，差异如下：a)在引言添加“注：已知对某抗菌剂固有耐药的细菌不做敏感性试验”的说明。b)将原文中的“nonselective nutritive agar
4、 medium”译成“非选择性琼脂培养基”(在临床检验实际工作中，非选择性培养基与营养琼脂是两种截然不同的培养基，而试验菌株从储存培养物到工作培养物的所有传代培养用固体培养基均建议使用前者。如此翻译是为了避免与营养琼脂相混淆)。c) 将“4质量控制质控菌株的工作培养物可通过储存菌株在非选择性琼脂培养基上再培养获得。”中的“再培养”改为“连续传代培养两次”；“储存菌株”改为“参考菌株的储存培养物”(结合临床检验工作的实际，并严格遵守CLSI在M7一A6中对菌株储存培养物连续传代培养次数的规定)。d)将“4质量控制进一步的传代培养只能用第一次工作培养物(不能超过一周)进行。”改为“4质量控制工作培
5、养物只能蒋传代一次，且使用时间不能超过一周。”(结合临床检验工作的实际，并严格遵守CLSI在M7一A6中对菌株工作培养物的使用时间及传代培养次数的规定)。为便于使用，本标准相对于国际标准原文还做了下列编辑性修改：a)将“本国际标准”一词改为“本部分”；b) 用小数点“”代替作为小数点的逗号“，”；c)删除国际标准原文中的前言。本部分的附录A为规范性附录。本部分由国家食品药品监督管理局提出。本部分由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会(SACTC 136)归口。本部分主要起草单位：北京市医疗器械检验所、南京医科大学附属第一医院。本部分主要起草人：童明庆、王辉。YYT 068812
6、008引 言抗菌剂体外敏感性试验通常是针对于可能导致疾病的微生物，尤其是那些被认为对频繁使用的抗菌剂呈现耐药性的微生物种属”。除此之外，该试验在细菌耐药性监测及其流行病学研究以及新抗菌剂与现有抗菌剂之间的比较等方面也很重要。稀释法常被用来测定抗菌剂的最小抑菌浓度(MICs，minimum inhibitory concentrations)，是抗菌剂敏感性试验的参考方法。MIC法通常用于细菌耐药性监测、新抗菌剂与现有抗菌剂之间的比较，该法也用于常规方法所得结果不可靠或f临床需要定量结果的微生物的敏感性试验。对于稀释法测试，某抗菌剂对于特定微生物的MIC值是通过观察微生物分别在含有系列稀释浓度的
7、该抗菌剂的一系列琼脂平板(琼脂稀释法)上或肉汤(肉汤稀释法)中的可见的生长能力来确定的。抗菌剂的最小抑菌浓度(MIC值)是指在规定的体外条件下，规定的孵育时间内，能抑制某特定微生物出现肉眼可见生长的抗菌剂的最低浓度(以mgL为单位)。MIC值有助于临床医师了解微生物对抗菌剂的敏感性从而帮助他们制定合理的用药方案。由于所用方法可能显著地影响试验结果，为了确保室内试验结果的可重复性和室间试验结果的可比性，实验室需要进行严格的质量控制及试验程序的标准化。通常情况下，对于给定的抗菌剂和试验菌株，肉汤稀释法的检测结果(MIC值)在MIC实际值1个倍比稀释度的范围内是可以被接受的。肉汤稀释法：是一种向一系
8、列相同体积的含抗菌剂的肉汤培养基(其中所含某抗菌剂的浓度通常是以几何级数递增的)中接种已知固定量某微生物以确定该微生物对该抗菌剂的MIC值的方法。肉汤微量稀释法：顾名思义，就是在微量稀释盘中进行肉汤稀释试验。本标准所描述的方法仅适用于需氧菌的纯培养物，这些细菌在Mueller-Hinton琼脂平板和Mueller-Hinton肉汤(可能需要加入添加剂)中经过夜孵育均易于生长。本标准所描述的肉汤稀释法本质上与法国、德国”1、瑞典“、英国43和美国等许多国家目前所用的方法是一致的，该法与欧洲抗菌剂敏感性试验委员会(EUCAST)”3所发布的肉汤微量稀释法是同一种方法，所有这些方法都是在Ericss
9、on和Sherris”3所描述方法的基础上发展而来的。1) 已知对某抗菌剂固有耐药的细菌不做敏感性试验。1范围临床实验室检测和体外诊断系统感染病原体敏感性试验与抗茵剂敏感性试验设备的性能评价第1部分：抗茵剂对感染性疾病相关的快速生长需氧菌的体外活性检测的参考方法YYT 068812008YYT 0688的本部分介绍了测定抗菌剂MIC值的一种参考方法一肉汤微量稀释法。MIC值仅反映抗菌剂在规定的体外试验条件下的抗菌活性。医生在制定用药方案时，不但要参考MIC结果，还应考虑诸如药物在人体内的药代药效学参数以及细菌对抗菌剂的耐药机制等其他因素。对于某种抗菌荆，根据体外敏感性试验结果(MIC值)可将相
10、应受试菌划分为“敏感(s)”、“中介(I)”和“耐药(R)”。另外，MIC值可用于确定该受试菌株是野生型还是非野生型。尽管解释MIC值的临床意义已超出了本部分的范畴，但为了适应I临床需要，根据不同抗菌剂一细菌组合对方法的基本内容进行调整是必要的。这些调整体现在下列各表格中。为了确保试验结果的可比性与可靠性，其他药敏试验方法(如常规方法或抗菌剂敏感性试验设备)应该和本参考方法进行比对以确定其准确性。2术语及定义下列术语和定义适用于YYT 0688的本部分。21抗菌剂antimicrobial agent一类可以抑制或杀死微生物，可能用于抗感染治疗的生物来源的、合成的或半合成的物质的总称。注：消毒
11、剂、灭菌剂和防腐剂不在此定义范围内。22抗菌剂属性properties of antimicrobial agents221效价potency受试物中有效抗菌活性成分所占比例，是受试物通过生物学方法所测值与相同质量或体积的参考品通过相同方法测得值的比率。注：效价的单位有毫克克(mgg)、国际活性单位克(IUg)或百分含量(，体积分数或质量分数)或受试物的物质的量浓度(toolL)。222浓度 concentration抗菌剂在规定体积溶液中的量。注1：常用毫克升(ragL)来表示。注2：虽然ragL-,ugmL，但不推荐使用gmL作为单位。23原液stock solutions用于进一步稀释的
12、初始浓度溶液。1YYT 06881200824最小抑菌浓度minimum inhibitory concentration MIC在规定的体外试验条件下，在规定的孵育时间内，能抑制细菌出现肉眼可见生长的最低浓度。注：常用mgI，表示。25折点break points BP用以界定受试细菌对某抗菌剂是敏感、中介或耐药的特定的MIC值。注：关于折点的最新解释，可参考应用本参考方法的机构的最新出版物。251敏感susceptible S受试菌株的生长可被某浓度抗菌剂抑制预示着该抗茵剂的I临床推荐剂量能够获得理想的疗效。注1：菌株是在规定的表型测试系统中基于合理的折点被判定为敏感的。注2：折点应根据测
13、试环境的改变(诸如药物常规剂量的改变、新的耐药机制的出现等)做相应调整。252中介 intermediate I受试菌株的生长可被某浓度抗菌剂抑制，但无法确定该抗菌剂临床推荐剂量的准确疗效。注1：菌株是在规定的表型测试系统中基于合理的折点被判定为中介的。注2：“中介”意味着由受试菌株导致的感染可通过该抗菌剂在患处的生理富集或使用更高剂量的该抗菌剂来获得妥善的治疗。注3：该级别还提供了一个“缓冲区”，从而避免了小的、不可控的技术因素所导致的重大的结果解释偏差。注4：折点应根据测试环境的改变(诸如药物常规剂量的改变、新的耐药机制的出现等)做相应调整。253耐药 resistance R受试菌株的生
14、长可被某浓度抗菌剂抑制预示着该抗菌剂的临床推荐剂量不能获得理想的疗效。注1：菌株是在规定的表型测试系统中基于合理的折点被判定为耐药的。注2：折点应根据测试环境的改变(诸如药物常规剂量的改变、新的耐药机制的出现等)做相应调整。26野生型wild type对某抗菌剂没有获得性耐药机制的菌株。27参考菌株reference strains有特定分类编号的，且抗菌剂敏感性表型和(或)基因型确定及稳定的菌株。注：参考菌株是从菌种保藏机构获得并作为质量控制，其通常以储存培养物的形式进行保存，试验所用工作培养物均来源于此。28敏感性试验方法susceptibility testing methods281肉
15、汤稀释法broth dilution是一种确定某微生物对某抗菌剂的MIC值的方法，即：向一系列含有某抗菌剂(通常倍比稀释)的适当体积的溶液中接种已知适当量的某微生物的接种菌液。注：该方法的目的是确定MIC值。282微量稀释法microdilution在微量稀释盘中进行的肉汤稀释试验，每孔最终工作液体积不超过200 pL。229液体培养基broth用于细菌体外培养的液体培养基。210接种量 inoculum依据接种后终体积计算出的细菌在最终菌药混合物中的数量。注；接种量通常以每毫升的菌落形成单位(CFUmL)来表示。211接种量效应inoculum effect由接种量的改变所导致的MIC值的变
16、化。3试验程序YYT 06881200831概述本试验是在微量稀释盘中进行的。该方法首先是抗菌剂工作液的配制，然后或者每孔加抗菌剂工作液50 pL(同时再加入50 pL接种物)，或者每孔工作液为100 pL(接种物的接种量最多不超过5 pL)。32培养基应使用Mueller-Hinton肉汤(详见附录A)。33抗菌剂331概述受试抗菌剂可直接从制造商或通过可靠的商业来源获得，但不能以J临床使用的药物制剂作为受试物。所有抗茵剂均应有批号、效价、失效日期及推荐的保存条件细节，如果制造商没有推荐其他的保存条件，一般受试物均在48条件下，保存于密闭、干燥、避光的容器中。抗菌剂的每个包装单位在整个试验过
17、程中均应有干燥剂。注：为避免受试物凝结成块，在打开装有受试物的容器之前，应将其恢复至室温。332原液的配制抗菌剂必须用校准过的分析天平称量。配制抗菌剂标准溶液时，可根据受试物的效价，通过下列公式计算出受试物的质量和稀释溶剂的体积。VpmP (2)式中：P 原液的浓度，单位为毫克每升(mgL)；m抗菌剂(干粉)的质量，单位为克(g)；P抗菌剂(干粉)的效价，单位为毫克每克(mgg)；v稀释剂的体积，单位为升(L)。虽然某些抗菌剂的溶解度有限，但抗菌剂母液的浓度至少应为1 000 mgL。原液的实际配制浓度取决于工作液(系列稀释浓度梯度)的配制方法。除非生产商有特殊的配制稀释要求，所有抗菌剂都应该
18、用无菌蒸馏水溶解并稀释。某些抗菌剂需要用特殊的溶剂来溶解(详见表1)。通常配好的抗菌剂工作液没必要进行消毒。如果必要，抗菌剂工作液可采用膜过滤除菌，但除茵前后的工作液应进行组分分析比较以确保抗菌剂样品在除菌过程中未发生吸附损失。如果抗菌剂溶液没有在指定储存条件下的稳定性信息，所有抗菌剂溶液都应该现用现配。3YYT 068812008表1 某些抗菌剂原液的制备所需的溶剂和稀释剂抗菌剂 溶 剂 稀释剂阿米卡星 蒸馏水(amikacin)阿莫西林(amoxieillin)01 molL的磷酸盐缓冲液(pH-6 o) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6 o)氨苄西林(ampicillin)01 m
19、olL的磷酸盐缓冲液(pH一8O) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH-60)阿奇霉素 95乙醇或冰醋酸1 水(azithromycin)阿洛西林(azlociIlin)蒸馏水氨曲南 饱和NaHCO。溶液 蒸馏水(aztreonam)羧苄青霉素 蒸馏水(carbeniciijin)头孢克洛(cefaclor)蒸馏永头孢盂多 蒸馏水(cefamando|e)头孢唑啉(cefazolin)01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6 o) 0 1 molI。的磷酸盐缓冲液(pH一6o)头孢地尼(cefdinir)01 molI，的磷酸盐缓冲液(pH一6o) 蒸馏水头孢托仑(cefditoren)01 m
20、olL的磷酸盐缓冲液(pH一6o) 蒸馏水头孢吡肟(cefepime)0 1 moI，的磷酸盐缓冲液(pH一6 o) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6 o)头孢他美(cefetamet)01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6o) 蒸馏水头孢克肟(cefixime)0I molL的磷酸盐缓冲液(pH一7o) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一7o)头孢美唑(cefmetazole)蒸馏水头孢尼西(cefonicid)蒸馏水头孢哌酮 蒸馏水(cefoperazone)头孢噻肟 蒸馏水(cefotaxime)头孢替坦(cefotetan) 二甲基亚砜蒸馏水头孢西丁(eefoxitin)蒸馏水
21、头孢泊肟 质量百分比浓度为01的NaHCO。溶液 蒸馏水(cefpodoxime)头孢丙烯 蒸馏水(cefprozil)4表1(续)YYT 0688卜一2008抗菌剂 溶 剂 稀释剂头孢他啶 饱和NaHCO。溶液 蒸馏水(ceftazidime)头孢布烯(ceftibuten)1lO(体积分数)的二甲基亚砜水溶液 蒸馏水头孢唑肟 蒸馏水(ceftizoxime)ceftobiprole 二甲基亚砜+冰醋酸5 蒸馏水，用涡旋振荡器剧烈振荡混匀头孢曲松(ceftriaxone)蒸馏水头孢呋辛(cefuroxime)01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一60) 01 moIL的磷酸盐缓冲液(pH一6o
22、)头孢噻吩0t molL的磷酸盐缓冲液(pH一6o) 蒸馏水(cephalothin)氯霉素 95(体积分数)乙醇 蒸馏水(chloramphenic01)先加人原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓西诺沙星 加入最小体积量的1 molL NaOH溶液直 蒸馏水(cinoxaein) 至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐环丙沙星(ciDrofloxacin)蒸馏水克拉霉素甲醇或冰醋酸6 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一65)(clarithromycin)克拉维酸fdavulanic acid)0 1 moiL的磷酸盐缓冲液(pH=6o) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6 o)克林沙星
23、(clinanoxacln)蒸馏水克林霉素 蒸馏水(cltndamycin)粘杆菌素(colistin)蒸馏水 蒸馏水daJbavancin 二甲基亚砜 蒸馏水和二甲基亚砜。达托霉素 蒸馏水 蒸馏水(daptomyein)地红霉素(dirithromycin)冰醋酸8 蒸馏水多尼培南(doripenem)085(体积分数)的NaCI溶液 085(体积分数)的NaCI溶液强力霉素蒸馏水(doxycycline)先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓依诺沙星 加人最小体积量的01 molL NaOH溶液 蒸馏水(enoxacin) 直至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐5YYT 0688120
24、08表1(续)抗菌剂 溶 剂 稀释剂厄他培南(ertapenem)001 rnolL的磷酸盐缓冲液(pH一72) 001 rnolL的磷酸盐缓冲液(pH一72)红霉素 95(体积分数)乙醇或冰醋酸5 蒸馏水(erythromycirt)法罗培南(aropenem)蒸馏水 蒸馏水先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓氟罗沙星 加人最小体积量的01 molL NaOH溶液 蒸馏水(fleroxacin) 直至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐夫西地酸(fusidic acid)95(体积分数)乙醇 蒸馏水加雷沙星 蒸馏水(搅拌溶解)(garenoxacin)加替沙星 蒸馏水(搅拌溶解)(gat
25、ifloxacin)gemifloxaein 蒸馏水庆大霉素 蒸馏水(gentamicin)亚胺培南(imipenem)0 01 molI，的磷酸盐缓冲液(pH一72) 001 molL的磷酸盐缓冲液(pH一7 2)卡那霉素 蒸馏水(kanamycin)先加入原液总体积的半的蒸馏水，再缓缓左旋氧氟沙星 加入最小体积量的1 moiL NaOH溶液直 蒸馏水(1evofloxacin) 至样品溶解，最后用燕馏水将原液总体积补齐利奈唑烷(1inezolid)蒸馏水氯碳头孢劳拉头孢(10racarbef)蒸馏水美西林(mecillinam) 蒸馏水美洛培南001 molL的磷酸盐缓冲液(pH一7 2)
26、 001 molL的磷酸盐缓冲液(pH一72)(meropenem)甲氧西林(methieillin)蒸馏水美洛酉林(mezlocillin) 蒸馏水米诺环素(minocycline)蒸馏水拉氧头孢磷酸氢二铵盐。(moxalactam用004 molL的HCl溶解后静置15 h-2 h01 molL的磷酸盐缓冲液(pH-6o)diammonium salt)。6表1(续)YYT 0688卜一2008抗菌剂 溶 剂 稀释剂莫西沙星 蒸馏水(NOxifloxacin)奠匹罗星 蒸馏水(mupirocin)萘夫西林(nafcillin)蒸馏水先加人原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓萘啶酸 加人最小体积
27、量的1 molL NaOH溶液直 蒸馏水(nalidixic acid) 至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积朴齐奈替米星(netilmicin)蒸馏水呋喃妥因 先用最少量的二甲基甲酰胺溶解，再用0 1 molL的磷酸盐缓冲液(pH一80)将原 01 moIL的磷酸盐缓冲液(pH一8O)(nitrofurantoin)液总体积补齐先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓诺氟沙星 加入最小体积量的1 moIL NaOH溶液直 蒸馏水(norfJoxacin) 至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓氧氟沙星 加入最小体积量的1 molL NaOH溶液直 蒸馏水
28、(ofloxacin) 至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐苯唑西林(oxacillin)蒸馏水青霉素(penicillin)蒸馏水哌拉西林 蒸馏水(piperacillin)多粘菌素B蒸馏水 蒸馏水(polymyxin B)quinupristin dalfopristin 蒸馏水利福平(rifampicin)甲醇 蒸馏水司帕沙星 蒸馏水(sparfloxacin)舒巴坦(sulbactam)01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一60) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH-60)先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓磺酰胺 加入最小体积量的1 molL NaOH溶液直 蒸馏水(sulpho
29、namide) 至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐替考拉宁 蒸馏水(teicopanin)7YYT 068812008表1(续)抗菌剂 溶 剂 稀释剂二甲基亚砜 蒸馏水泰利霉素(telithromycin)冰醋酸8 蒸馏水四环素 蒸馏水(tetracycline)替卡西林01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6o) 01 molL的磷酸盐缓冲液(pH一6 o)(ticarcillin)替加环素蒸馏水 蒸馏水(tigecyeline)妥布霉素 蒸馏水(tobramycin)先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再缓缓甲氧苄啶 加入最小体积量的01 molL的乳酸或 蒸馏水(trimethoprim
30、) 01 moiL的盐酸直至样品溶解，最后用蒸馏水将原液总体积补齐甲氧苄啶盐(如乳酸盐) 蒸馏水(trimethoprim，if lactate)丙大观霉素 蒸馏水(trospectomycin)万古霉素 蒸馏水(vaneomycin)注1：关于表1中溶剂及稀释剂的信息主要是经CLSI(即NCCLS)许可来源于其M100一$16文件(抗菌剂敏感性试验执行标准；第16版信息增刊)。由于该部分信息是定期更新的，所以请实验操作者经常查阅可从CLSI(即NCCLS，940 West ValleyRoad，Suite 1 400，Wayne，PA 19 087，USA)获得的最新版本。注2：关于所选抗菌
31、剂原液的溶剂及稀释剂的更详细的信息，请参考欧洲药典和美国药典。8如果用冰醋酸作为溶剂，具体的溶解步骤为：先加入原液总体积的一半的蒸馏水，再逐滴加人冰醋酸直至抗菌剂完全溶解，乙酸在原液中的终浓度不应超过25 mgL，冰醋酸即99(体积分数)的乙酸。6每15 mg Ceftobiprole原液的配制：先加人二甲基亚砜与冰醋酸按体积比10：1混合的混合液110 pI，用涡旋振荡器剧烈振荡1 min，振荡结束15 rain后用蒸馏水稀释至总体积10 mL。粘菌素(Colistin)在抗菌剂敏感性试验中的具体形式为粘杆菌素硫酸盐而不是粘杆菌素的甲基磺酸盐。6 Dalbavancin起始原液的配制浓度应不
32、超过1 600 mgI，中间的100原液浓度的储存液应用二甲基亚砜稀释起始原液获得最终原液为用补加有0002(体积分数)的聚山梨醇酯一80的阳离子调整过的MuellerHinton肉汤(CAMHB)，从而使得最终二甲基亚砜在每孔中的浓度不会超过1。拉氧头孢磷酸氢二铵盐非常稳定，但其中的拉氧头孢几乎全部以R型异构体存在，而拉氧头孢的临床应用形式为R型与S型异构体的等摩尔混合物，故拉氧头孢磷酸氢二铵盐用004 molL的HCI充分溶解后应静置反应15 h-20 h，使其中的R型拉氧头孢转化为R型与S型的等摩尔混合物。333工作液的配制试验用抗菌剂工作液浓度范围的选择取决于试验菌株和抗菌剂本身这两方
33、面的因素，所选浓度范围对于相应的参考菌株来说，必须能够确定所有可能得出的终点MIC值。抗菌剂工作液倍比稀释系列通常应用Mueller-Hinton肉汤配制并围绕1 mgL展开。工作液系列不应通过逐步稀释获得。根据表2所述程序，如果抗菌剂溶液没有在指定储存条件下的稳定性信息，所有工作液均应当天配制当天用完。8YYT 068812008表2 肉汤稀释法敏感性试验中抗菌剂工作液稀释系列的配置方法抗菌剂原液浓度(ragL) 原液体积mL 肉汤体积。mL 工作液终浓度(mgL)5 120 l 9 512512 1 1 256512 1 3 128512 1 7 6464 l l 3264 1 3 166
34、4 1 7 88 1 1 48 1 3 28 1 7 11 1 1 051 1 3 0251 1 7 01258稀释所用的肉汤即敏感性试验所用的肉汤。为了保持必要的浓度，在稀释抗菌剂之前，所有补加成分均应提前加好。334微量稀释盘的制备微量稀释盘每孔加入2倍的所需终浓度的抗菌剂工作液50 pL，或每孔加入100 pL所需终浓度的抗菌剂工作液。至少应保留一个加入50 pL或100 pL不含抗菌剂的培养基的孔以作为每株试验菌的生长对照。同样，还应设置一个仅加入100 pL无抗菌剂培养基但不接种的阴性对照孔。335微量稀释盘的储存充装好的微量稀释盘可以立即使用，也可以储存起来，但储存时间最多不应超过
35、3个月。除非稀释盘中的抗菌剂在温度高于一60时是稳定的，否则制备好的稀释盘应密封于塑料袋中迅速置于温度在60以下的环境中进行储存。尽管稀释盘中抗菌剂在冷冻状态下可稳定数月。但有些抗菌剂(如克拉维酸和亚胺培南)比其他抗菌剂更不稳定，必须在一60以下保存。此外，稀释盘不应存放于可自动除霜的冰箱里，融化的抗菌剂溶液不应被复冻，因为反复冻融可加速某些抗菌剂(特别是p内酰胺类抗生素)的降解。34接种菌液的制备341概述接种菌液的标准化对于肉汤稀释法抗菌剂敏感性试验结果的准确性和可重复性是非常关键的。因此，每个分离菌株都应按照本参考程序进行纯度检测和可视的菌落计数。接种菌液可通过稀释菌株的肉汤培养物或选取
36、经非选择性琼脂培养基(可根据培养菌株的不同加入适宜的添加剂)培养过夜的菌落用肉汤或生理盐水直接悬浮而成。不论用哪种方法，培养过夜均建议从非选择性琼脂培养基上挑取45个纯培养菌落来进行，从而避免漏掉非典型的变异株。接种菌液的终浓度应该为5105 CFUmL2105 CFUmL8105 CFUmL。342肉汤增菌法用无菌接种环从非选择性琼脂培养基上挑取35个菌落，转种至肉汤(如大豆胰蛋白酶消化肉汤或脑心浸提液肉汤)中，前提是肉汤不影响受试抗菌剂的作用。接种后的肉汤置3437环境中孵9YYT 0688卜一2008育直到浊度大于等于05麦氏标准(McFarland standard)，必要时可用无菌生
37、理盐水或肉汤调节菌液浊度至05麦氏标准；这一步也可用分光光度计(波长选取625 nm，1 cm光径的比色杯，吸光度在008O13之间)或经校准过的合适的比浊仪来实现；此外，还可以通过调节菌悬液的浊度，使得透过菌悬液和05McFarland标准比浊管观察同一黑色线条获得相同清晰度来完成(菌悬液应用与05McFarland标准比浊管相同大小的试管盛装)。其他测量重复性好的方法也可以使用。注；05McFarland标准比浊管的配制；将05 mL整数倍体积的0048 molL的BaCIz溶液即1172 gL的BaClz2HzO溶液用018 molL的H：SO。溶液补至总体积为100mL，边加边均匀搅拌
38、以维持均匀的浊度。343直接菌悬液法用无菌接种环从非选择性琼脂培养基上挑取35个菌落(如果不需要更长的孵育时间，一般划线接种后的非选择性琼脂培养基在3437环境中孵育18 h24 h即可进行此步)，悬于无菌肉汤(如大豆胰蛋白酶消化肉汤或脑心浸提液肉汤)或生理盐水中，按442中所描述的方法，调节菌悬液浊度至05麦氏标准。对于所有细菌来说，最终接种液中活菌的准确浓度取决于过夜培养细菌的生长状态，尤其是苛养菌(如肺炎链球菌)，培养时间较长可能会严重降低菌悬液中的活菌数量。对于常见的细菌，按上述方法正确调节至05麦氏标准的菌悬液的细菌量约相当于1108 CFUmL。按上述步骤制备好的05麦氏标准初始菌
39、液还需要用肉汤及微稀释盘L中的抗菌剂工作液稀释成活菌浓度为5105 CFUmL2105 cFumL8105 CFUmL的终溶液(即微稀释盘孔中的最终工作菌液)。具体的稀释步骤取决于所用试验菌株(的活菌计数)和接种方法。对许多革兰氏阴性细菌(如大肠埃希菌)而言，稀释步骤为先将o1 rnL标准菌悬液(o5麦氏标准，l103 CFUrr“L)加到99 rrlL肉汤中，得到1106 cFumL的菌悬液(1：100倍稀释)，再将50 pL此浓度的菌悬液加入到微稀释盘孔中等体积(50 pL)抗菌剂工作液中，菌液的终浓度即为510 5 cFumL。如果微稀释盘孔中事先已经装有100此抗菌剂工作液，则应制定适
40、宜的稀释步骤使得最终工作菌液活菌浓度达到5103 cFumL，但必须确保向微稀释盘孔中加入的菌悬液体积不超过5 pL。而对于革兰氏阳性细菌来说，应按预试验中活菌计数结果对05麦氏标准的菌液进行较少的稀释。35微量稀释盘的接种为了使每孔的活菌浓度数保持恒定，按标准操作程序配制的接种菌液应该在30 min内接种至微量稀释盘上。对于每孔抗菌剂工作液量为50“L的稀释盘，每孔应接种50 pL菌液；而对于每孔抗菌剂工作液量为100 pL的稀释盘，则每孔接种的菌液体积最多不应超过5 pL。试验菌株的初始菌液应进行活菌计数，以确保每孔最终工作菌液的活菌浓度约为5105 CFLmL。具体即：稀释盘接种完成后迅
41、速从生长对照孔中取10止用10 mL的肉汤或生理盐水稀释，再取此稀释终液100 pL涂布到适宜的琼脂平板表面，过夜孵育后进行菌落计数，每个平板菌落数量应该在2080之间，如果菌落数量超出此范围，则该菌株的试验结果不能被采用。36微量稀释盘的孵育接种好的微量稀释盘在孵育之前，应密封于聚乙烯袋中、或用密封盖或粘胶封条封住，以防止最终工作菌液在孵育过程中失水浓缩。为防止孵育不均匀，稀释盘叠放时高度不应超过5块。如果没有其他特殊要求，接种好的微量稀释盘应在3437的环境中孵育(18士2)h。注意不要在富含COz的环境中孵育。37结果的判读只有当受试菌株在微量稀释盘的生长对照孔中充分生长(即阳性生长对照
42、孔底部出现沉淀或液体混浊时)、未接种的或阴性生长对照孔没有细菌生长、接种菌液符合纯培养且活菌浓度符合要求，才可进行结果判读。每孔试验菌株的生长量和阳性生长对照孔进行比较，MIC值即为能完全抑制细菌可见生长的最低抗菌剂浓度。1 0YYT 06881200838 MIC结果可能不能反映抗菌剂真实活性的特殊情况及其处理在某些情况下，抗菌剂的MIC值不能真正反映其抗菌活性，因此对于这些抗菌剂试验结果的解释应做适当的修改以便于临床应用。有些情况下，参考方法需做修改，如改变孵育条件或调整培养基等。另外，用标准参考稀释法进行试验时，细菌的某些耐药机制，如p内酰胺酶、外排泵的表达和药物作用靶位的改变不一定总能
43、表达，针对这些情况，对MIC结果的解释应慎重，或提供其他信息以指导临床抗感染用药。表3所列的几种抗菌剂一细菌组合应引起特别的关注。表3特殊试验情况抗菌剂种类 受试菌株种属 备 注对于野生型粪肠球菌和屎肠球菌，庆大霉素和妥布霉素的MIC中值范围在8 mgL16 mgL，链霉素的MIC中值范围在8 mgL32 ragL。通常，氨基糖苷类抗菌剂和作用于细菌细胞壁的抗菌剂(如青霉素类、碳氨基糖苷类 肠球菌属 青霉烯类和糖肽类)联合使用具有协同效应，但对于对氨基糖苷类抗菌(aminoglycosides) 剂高耐药(MIC500 mgL)的肠球菌而言，则无协同效应。因此，在进行此类抗菌剂细菌敏感性试验时
44、，浓度稀释范围应设计得足够太，从而能检测到高水平耐药，试验过程中庆大霉素的孵育时间应为24 h，链霉素应为48 h，p内酰胺类 所有细菌 如果细菌产生某些内酰胺酶，则MIC值可能不能用来预测该抗菌剂的(B_lactams) 疗效。因此，对MIC结果的解释要慎重。肉汤微量稀释法检测meca基因介导的耐药可能不可靠，下面的各种关于试验方法的修改可能有助这类耐药的检测：甲氧西林在肉汤中加入NaCl，使其终浓度达到20 gL；(methicillin)葡萄球菌届 试验孵育时间不少于24 h；苯唑西林(oxacillin)孵育温度在30-35之间；用直接菌悬液法制备接种菌液，而不用肉汤增菌法。检测mec
45、A基因是检测甲氧西林苯唑西林耐药性的参考方法。达托霉素 所有细菌培养基中ca2一的终浓度应补充到50 mgL。(daptomycin)肉汤微量稀释法的检测结果可能不可靠。应选琼脂稀释法作为参考方磷霉素所有细菌 法嘲，试验用琼脂培养基中应补充终浓度为25 mgL的6磷酸一葡(fosfomycin) 萄糖。糖肽类 所有细菌 为保证MIC结果的稳定可靠，接种后应孵育24 h后判读结果。(91ycopeptides)糖肽类 金黄色 肉汤微量稀释法不能可靠的检测出耐糖肽类抗菌剂的中介金黄色葡萄(gIycopeptides) 葡萄球菌 球菌。环甘氨酰类(glycylcyclines) 所有细菌 培养基必须
46、新鲜配制，12h内使用。替加环素(tigecycline)林可酰胺类 如果细菌可诱导产生甲基化酶(MLSB耐药)，则MIC结果可能不能预测(1incosamides)所有细菌 临床的实际疗效。磺胺类和甲氧苄啶(sulphonamides and 所有细菌 MIC值是指与生长对照孔比较，能抑制80细菌生长的最低药物浓度。trimethoprim)YYT 0688120084质量控制试验结果的质量应通过同时进行的质控菌株的敏感性试验(见表4)来监测。储存质控菌株应以冻干粉形式保存或在一60环境中冷冻保存，质控菌株的工作培养物可通过参考菌株的储存培养物在非选择性琼脂培养基上连续传代培养两次获得。工作
47、培养物只能再传代一次，且使用时间不能超过一周。每个MIC测定日至少应选取两株相同类型的质控菌株和日常标本共同进行培养和抗菌剂敏感性试验，且各质控菌株对各抗菌剂的MIC检测结果应该在表4规定的范围内。表4质控菌株的MIC(mIgL)范围金黄色葡萄球菌 粪肠球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 肺炎链球菌ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC2921酽 29212 25922 27853 35218 49619NCTC NCTC NCTC NCTC DSM NCTC抗菌剂 129730 12697 12241 12973 5j 64 12977CIP CIP CIP CIP103429 103214 7624 76110DSM DSM DSM DSM2569。 2j70 1103 1117阿米卡星 14 64256 054 1
