1、中华人民共和国国家标准黑热病诊断标准及处理原则GB 15986 1995 Diagnostic criteria and principl帽。fmanagement of kala-a皿r根据中华人民共和国传染病防治法及中华人民共和国传染病防治法实施办法制订本标准。1 主题内容与适用范围本标准规定了黑热病的诊断标准、治疗方法及防治原则。本标准适用于疫区专业机构开展黑热病防治工作和全国各级各类医疗E生机构对黑热病患者的诊拾。2诊断原则根据流行病学史、临床表现以及寄生虫学检查和血清免疫学方法，予以诊断。3诊断标准3. 1 黑热病黑热病通过白岭叮咬而传播，主要病变发生在内脏，少数特殊病例则以皮肤损害
2、或单纯淋巴结肿大为主要症状，分别称皮肤或淋巴结型黑热病。狗也可患此病，称犬内脏和j什曼病，是我国山丘地区黑热病的主要动物宿主，当地人的感染大多来自病犬。3. 1. 1 黑热病流行区内的居民，或在白岭季节内（59月）曾进入流行区居住过的人员。3. 1.2 长期不规则发热，脾脏里进行性肿大，肝脏轻度或中度肿大，臼细胞计数降低，贫血，血小板减少或有鼻阻及齿眼出血等症状。3. 1. 3 在骨髓、膊或淋巴结等穿和l物涂片上查见利什曼原虫，或将穿和j物注入三恩氏（NNN）培养基内培养出利什曼原虫的前鞭毛体（详见附录A）。3. 1. 4 用间接荧光抗体试验（！FA），酶联免疫吸附试验（ELISA),PVC薄
3、膜快速ELISA，间接血凝IHA）等方法检测抗体呈阳性反应p或用单克隆抗体斑点ELISA(McAb斑点ELISA直接法或单克隆抗体抗原斑点试验（McAb-AST法以及单克隆抗体酶联免疫电泳转移印斑试验（EITB）检测循环抗原呈阳性反应（详见附录B）。疑似病例：具备3.,3.J.2条。确诊病例：疑似病例加3.I. 3条。临床诊断疑似病例加3.I. 4条。3. 2皮肤型黑热病3. 2. 1 多数病例在数年或十余年前有黑热病史，也可发生在黑热病病程中；少数患者无黑热病史，为原发性病例。3.2.2 在面、四肢或躯干部有皮肤结节、丘彦和红斑，偶见褪色斑，白细胞计数可增至10OOO/mm3，嗜酸性粒细胞常
4、在5%以上。3.2.3从结节、丘珍处吸取的组织液或皮肤组织刮取物的涂片上查见利什曼、原虫3. 2. 4 McAb dot-ELISA法检测循环抗原呈阳性反应。国家技术监督局1995-12-15批准300 1996-07-01实施疑似病例：具备3.2. 1 3. 2. 2条。确诊病例疑似病例加3.2. 3条。临床诊断z疑似病例加3.2. 4条。3. 3 淋巴结型黑热病GB 15 986 1995 3. 3. 1 病人多发生在臼岭季节内由非流行区进入以婴幼儿发病为主的黑热病流行区（荒漠、山丘地带）居住或旅游的成年人中。3. 3. 2 颈、耳后、腋窝、腹股沟或滑车上的淋巴结肿大如花生米至蚕豆般大小，
5、较浅，可移动。肝脾不肿大，嗜酸粒细胞增多。3. 3. 3 从肿大的淋巴结吸取组织液涂片检查或从淋巴结的组织切片上查见利什曼原虫。疑以病例z具备3.3.1,3.3.2条。确诊病例z疑似病例加3.3. 3条。4 处理原则4. 1 治疗（详见附录。4. 1. 1 黑热病4.1.1.1 初治病例斯锦黑克（五价葡萄糖酸锦纳）六日疗法成人总量120150mg锦kg，儿童总量200240mg锦阳，平分6次，每日肌肉或静脉注射一次，6天为疗程。斯锦黑克三周疗法g成人总量133mg锦kg，儿童总量200mg镑kg，平分6次，每周肌肉或静脉注射2次，三周完毕一疗程。此法适用于体质差或病情较重的患者。4.1.1.2
6、 经一疗程未愈或复发病人s斯锦黑克的剂量应在六日疗法的基础上加大1/3，改用八日疗法进行治疗。4.1.1.3对镑剂有抗性的病例，任选以下一种方案s戊胶眯4mg/kg每日或隔日肌肉注射次，总量为60mg/kg；经昧良每次23mg/kg肌肉或静脉注射，总量为85mg/kgo4. 1. 2 皮肤型黑热病斯锦黑克六日或八日疗法，连续23个疗程。戊肮滕疗效较好，每次4mg/kg，肌肉注射，总量为6080mg/kg，般即可治愈。如皮肤损害仍未完全消失，可再给予一疗程。4. 1. 3 淋巴结型黑热病斯锦黑克剂量和疗程同4.1.1.1.4.2预防4. 2. 1 消灭病犬z山丘地带的黑热病流行区，应及时使用寄生
7、虫学检查和血清免疫学方法查出感染内脏利什曼病的犬，加以杀灭。在病犬较多的地区，应动员群众少养或不养家犬。4. 2. 2 灭蛤z在仍有黑热病流行的平原地区，经监测如媒介白玲的密度较高，应使用杀虫剂于自岭季节初喷洒住屋和畜舍。在山丘、荒漠地带在臼龄季节内查见病人后，可用杀虫剂喷洒病家及其四周半径15m之内的住屋和畜舍，以歼灭自野外入侵室内的自岭。4.2.3 防岭使用蚊帐、蚊香，燃点干燥的野艾烟熏驱聆；不露宿，提倡装置细孔纱门纱窗。在山丘地带的黑热病疫区内，可在白蛤季节内用杀虫剂（如澳氧菊酶等）喷淋犬体，以杀死或驱除前来刺叮吸血的自蛤。夜间在荒漠地带野外的执勤人员，应在身体裸露部位涂擦驱避剂。:10
8、 I A1 病原检查A 1- 1 榕骨穿刺GB 15 986一1995附录A病原学诊断（补充件）A 1. 1. 1 病人侧卧，露出带骨部位，用手指确定骸骨上棘，将该处周围皮肤用礁酒及酒精消毒，一般在局部麻醉下进行。A1.1.2 穿刺针的大小，视病人年龄不同而异，婴儿及幼童用20号穿刺针，年龄较大的儿童及青年可用5cm长的18号腰椎穿刺针，成人用17号穿刺针，均需经压力蒸气灭菌。A1.1.3 以骸骨前上棘后约！cm为穿刺处，先刺入皮肤，然后将针竖起，使与水平线成70。80，穿过皮下组织及骨膜后，即能觉出针头己触及骨的表面，可用旋转式的动作，将针尖钻入骨内。A1.1-4 按病人年龄大小及胖瘦不同，
9、穿刺的深度为0.5!. Ocm，由浅入深，只要放手后针不斜倒，表示针尖已入骨内，可将针轴拔出，接以2mL或5mL注射器，抽得骨髓后，应立即将穿刺针拔出，将骨髓制成涂片以便检查。A1.1. 5 骨髓涂片制成后让其自然干燥，用记号笔编号。染色前先用甲醇固定，将吉氏液以水配制成3%的稀释液，染色30min，或在2mL水中加吉氏液3滴，滴在涂片上，染色20mi口。然后用流水轻轻冲洗晾干，即可用光学显微镜（油镜）检查。A 1. 2 淋巴结穿刺A 1. 2. 1 一般均选择腹股沟部位，其他部位的淋巴结如属肿大，亦可用作穿刺。A 1. 2. 2 淋巴结肿大处的局部消毒后，用洗净的左手拇指和食指握住一个淋巴绪
10、，向上提起，并使其固定于两指之间，注意穿刺部位不得污染。右手取高压消毒的针头，先穿过皮肤，然后刺入淋巴结内，待数秒钟后即可将针头拔出，无需用针筒抽吸。A1.2.3 将针内的淋巴组织液射在玻片上，由于所获的液体量甚少，应仔细111涂片。A 1. 2. 4 涂片染色镜检参见Al.!.5。A 1- 3 皮肤刮片检查局部皮肤消毒后，以洗净的左手拇指和食指捏住皮肤结节，使其固定于两指词，再用灭菌干燥手术刀轻轻切开皮肤，刮取切口两侧的皮肤组织，制成涂片，染色镜检。A 1. 4 三恩基的制备g琼脂14.0日，氯化销6.饵，蒸馆水900mL，盛入烧瓶中加热熔化，分装试管，每管3mL。经压力蒸气灭菌待稍冷却后每
11、试管加入相当1/3量的去纤维兔血，均匀混合后斜置待冷，。冷却后每管加入0.5mL 洛克氏溶液，4c冷藏备用。A 1. 5 原虫培养在严格的无菌操作下，把抽吸到的骨髓、淋巴液注入培养基内，或切取皮肤黑热病患者的小块皮肤组织投入三恩基内，置2224温箱内培养，15天后用白金耳取少量培养液置显微镜下检查，如查见利什曼原虫的前鞭毛体，即可确定诊断。302 Bl 检测抗体Bl. 1 Iii接荧光抗体试验（IFAl GB 1 5 9 8 6-1 9 9 5 附录B血清学诊断（补充件）一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血滴法。Bl.1.1 抗原片：收集经三恩氏（NNN）基培养10天左右
12、的利什曼原虫前鞭毛体离心沉淀（3OOOr/ min) 15min，弃上清液，加生理盐水冲匀，再经离心洗涤3次后用含0.2%福尔马林O.Olmol/L pH7. 2 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定，置冰箱内lh取出，离心沉淀，弃上清，再用PBS洗涤一次，稀释至每个视野50100个鞭毛体，滴于玻片上，电扇吹干。此抗原片，可置一20冰箱中备用。B1. 1. 2 干血滴的制备：在滤纸上圈画1.2cm直径的圆圈，在圈内滴入2滴（相当于20mm）病人耳垂血，晾干后放入装有干燥剂的塑料袋内，置冰箱保存待查。B1. 1. 3 从滤纸上剪下干血滴，以0.2mLO. Olmo!/!, pH 7. 2的PBS浸泡，
13、相当于1 20血清的稀释度（如被检样本为血清，则作1 20稀释），置冰箱内过夜。试验时继续作倍比稀释至1 320或1 640，把不同稀释度的血清或干血滴浸泡液分别滴在抗原片上，置湿盒内于37c温育30min后，用pH7.2 8.0 的PBS缓慢洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS浸泡1Omin，继续用蒸馆水洗一次，电扇吹干。Bl.1.4 分别滴加I10稀释的荧光标记的羊抗人lgG，置湿盒内于37温育30min，如前清洗电扇吹1：待检。B1. 1. 5 检查时在玻片上加蒸馆水一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜或用640倍的光学显微镜在高压求灯荧光光源的配合下进行观察。阳性者虫体的胞浆及鞭毛呈黄绿色荧光
14、，轮廓清楚，而核及动基体般不显荧光。Bl. 1.6 每次试验均以病人干血滴（或血清）和正常人干血滴（或血清）浸泡液及PBS作对照，由于正常人血样在1 20稀释时亦偶可出现“”，故以“”为阳性标准，并以1 20（即l 20）为最低阳性稀释度。Bl. 2 PVC溥膜快速ELISAB 1. 2. 1 抗原（前鞭毛体可溶性抗原）收集利什曼原虫前鞭毛体，以生理盐水离心洗涤3次，按压积体和、加10倍量的0.01 %硫柳乘生理盐水，在冰浴中超声处理2次，每次lOmin，反复冻融5次，经4OOOr/ min离心3min，上清液存20贮存备用。Bl. 2. 2 操作方法Bl.2.2.1 实验前先在PVC致敏膜背
15、面上编号，然后每孔加血清稀释液（PBS/T)0. 2mL。u1.2.2. 2 按编号加入待测血清及参考血清（每批设一个阴性对照，个阳性对照），每孔lOL，混匀置37 C 5min（如放25室温，则需10min）。Bl. 2.2. 3 温育后，倾去稀释血清，用洗涤液（NaCl/Tl连续洗8次，空干。Bl.2.2.4 加入按工作浓度稀稀的酶结合物，每孔0.2mL，放37内5min, u1.2.2.5 倾去酶结合物，先用洗涤液洗8次，再用蒸馆水洗一次，空干。Bl.2. 2. 6 加入己加3%过氧化氧（H202）的四甲基联苯胶（TMBS）底物液，每孔O.Zml.，反应5!Omin，即可观察结果。Bl.
16、2.3 反应标准2目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性为鲜蓝色，阴性基本无色。:; II; GB 1 5 9 8 6 -1 9 9 5 分光光度汁比色判断z不用过氧化氢（H,0，）终止，选用595nm波长比色，以PIN2.1判为阳性(P 患者的光密度值；N正常人的光密度值。B1. 3 间接血凝法（IHA)B1. 3. 1 取培养1012天的利什曼原虫前鞭毛体，用生理盐水洗涤，按压积量加4倍生理盐水，于冰浴中用150W,J8kc,300mA功率超声处理！Os，以pH6.4,0. 075mol/L的PBS稀释20倍。Folin盼试法i则蛋白量为200pg/ml，。B1. 3. 2 醒
17、化z用健康人“。”型红细胞加10倍生理盐水离心45次。每8mL压积红细胞加1%戊二酸lOOmL，在4C水浴中摇动30min，醒化红细胞再用生理盐水和蒸馆水或去离子水各洗5次，最后稀释成15%，另加万分之一硫柳隶防腐，置冰箱内保存。B1. 3. 3致敏用pH7.2, 0. 75mol/L的PBS将醒化红细胞稀释为1.5%.离心洗3次，配成5%的细胞悬液加等量万分之一的草草酸溶液，置37水浴中30min，每35min摇一次，用5倍量上述的PBS洗3次，再用pH6. 4, O. 075mol/L的P因配成2.5%的红细胞悬液，然后以此红细胞悬液加等量pH6. 4的PBS稀释20倍的抗原，在37c水浴
18、中致敏45min，并加摇动，2OOOr/min离心3min后奔上清，加pH7. 2的PBS重复离心一次，最后以含有1%正常兔血清的pH7. 2的PBS配成1%备用。B1. 3. 4 将定量生理盐水滴加于稀释板上，于第一孔内加等量待检血清，混匀并倍比稀释成2-1.2 2等浓度。取每一浓度血清0.025mL分别加入微量血凝板的12个6mm7mm的“V”井内，再加等量致敏红细胞摇匀，置于湿纱布盒内，经室温lh后判定结果，同时用参考阳性和阴性血清作对照。凡患者血清稀释度达27凝集者作阳性阀值，无凝集者为阴性反应。B2检测循环抗原B2. 1 单克隆抗体抗原斑点试验（McAbAST) B2. 1. 1 待
19、检血清递次作倍比稀释，分别取2L滴于硝化纤维滤膜（0. 45pm）上，室温放置30min。B2. 1. 2 将滤膜浸入标准缓冲液（0. lmol/L三泾甲基氨基甲烧）(Tris) HCl pH 7. 4. o. 25 %明胶，0. 5% NP-40 ）内，室温础。li2. 1. 3取出滤膜浸入McAb-C-2(1 100稀释）内，4过夜。B2. 1. 4 以缓冲液洗涤后与辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗鼠IgG(l 1 000），于室温中孵育2h.B2. 1. 5 洗涤后将滤膜置二氨基联苯胶底物液中，室温内反应30min，蒸馆水洗涤终止反应。B2. 1.6 滤蟆干燥后目测以出现深棕色或棕色斑点
20、，边缘清晰，直径较正常人血清反应为大者则判为阳性反应。未出现棕色斑点，与正常对照血清反应相近者为阴性反应。为更精确阅读结果，可待滤膜干燥后用岛津双波长TJ,C扫描仪（CS-910,S460nm）测读光密度面积积分（Integralof surface area. ISA), 阙值l.0以上者为阳性反应；阀值l.0为阴性反应。B2. 2酶标记单克隆抗体斑点ELISA直接法（McAbdot ELISA) B2. 2. 1 以戊工隆二步法标记提纯的单克隆抗体制备成HRP-McAbLl2F7 3oc保存备用。B2. 2. 2 将待测血清依次作倍比稀释至1 8。吸取2L样本滴于硝酸纤维膜上，4阴干。B2
21、. 2. 3 滴有血清的硝酸纤维（NC）膜置于标准缓冲液（0.lmol/L Tris HCl pH 7. 4 o. 25%明胶，0.5% NP 40）内，室温摇床洗涤4次，每次lOmin,B2. 2. 4 洗涤后加1 100稀释的HRP-McAb，室温摇床拙，标准缓冲液洗涤6次，每次lOmin,B2. 2. 5 加底物4氯乙荼盼摇床lOmin，水洗中止反应。B2. 2. 6 日测以出现蓝灰色斑点者为阳性反应。阴性则无蓝灰色斑点或仅有血清痕迹。B2. 2. 7 每次试验均需设有阳性及阴性对照。B2. 3 单克隆抗体酶联免疫电转移印斑技术（McAb-EITB)B2. 3. 1 血清样品处理z每份待
22、检血清各取50L,:IJOpH 7. 4的PBS至lmL,3 OOOr /min30min，取上清）川0.2ml,30 %聚乙二醇（PEG分子量6000),4过夜，3OOOr /min30min，再以50%PEG洗涤，3OOOr I （)4 GB 159861995 min30min，最后沉淀物加50fLPBS溶解备用。B2. 3. 2 十工烧基硫酸纳一聚丙烯酸胶凝胶电泳。OSPAC;E）技术z实验使用10%分离胶（浓缩液3. 31d.,3mol/J, Tris HCI 1. 25ml.,10%十二烧基硫酸锅。OS)lOOL，四甲基乙二胶（TEMED)5fL, 10%过硫酸胶Ap50fl.）。
23、3%浓缩胶（浓缩液。5mL.lmol/LTris HCI 0. 625mL,H,C),3. 8ml.,10% SOS 50fl., TEMED 5fl-, JO% Ap 25fL）。待胶板聚合完成后，每槽I二样处理血清2L，将制板插入电泳槽中.2oov电泳50min, B2. 3. 3 电泳转移将胶膜覆盖在硝酸纤维膜上对正，排除气泡。开动电源，电流为200mA，电压为15V，电泳30n1inNl可。B2. 3.4 转移后硝酸纤维膜用标准缓冲液（TrisHCI pH 7. 4，明胶0.25 % , 0. 5 NP 40）洗三次，每次!Omin。B2. 3. 5 加1 500稀释的HRP-McAb
24、Ll2H4.37 C lh后4过夜，标准缓冲液洗三次，DABH,Cl，系统显色！Omin，水洗中止反应。B2. 3. 6 日测特异性条带，以130k0、lOOkD和25kD为阳性条带。C1 抗黑热病治疗附录C治疗（补充件）c1. 1 初治病人采用斯锦黑克六日疗法或对重症黑热病患者的三周疗法，应尽可能作静脉注射，把斯锦黑克从静脉缓缓注入。在用六日疗法治疗过程中，如病人出现高热、鼻阻和脾区疼痛等副反应，可停针数日，待症状缓解后再继续注射，药物总量可与先前注射的合并计算。C1. 2 未治愈病人：患者经一个疗程斯锦黑克治疗后半个月复查时，如体温仍高于正常，臼细胞计数未见增加，牌肿依旧，原虫并不消失，应
25、认为治疗无效，可加大斯锦黑克的剂量，比原剂量增加1/3，采取八夭八针疗法进行第二个疗程。C1. 3 复发病人：黑热病经治疗后体温已恢复正常一般情况和血象都有好转，牌肿亦见缩小，穿刺检查不复能找到利什曼原虫，但相隔数月后（般在半年内）体温上升，牌肿复见增大，骨髓i涂片上又查见原虫，即为复发。仍可用斯锦黑克治疗，应在原剂量基础上加大1/3,C1. 4 抗锦病人：经锦剂三个疗程以上仍未痊愈的病人。临床上称为抗锦性黑热病病人，可采用以下两种泞香双眯类药物进行治疗。戊院脐（pentamidine），在每次注射前把药物先溶解于无菌蒸馈水内配成4%的溶液，作肌肉注射每次4mg屿，每日一次，连续15天为一疗程
26、，总剂量为60mg峙。在药物注射过程中注射局部可产生红肿等反应，可用局部热敷法以减轻反应。偶尔发生血压下降出现脉搏增速、眩晕、心悸等反应，注射肾k腺素即叮消失。ri脉民（tlydroxystilbamidine）每次I愤用前先用少最蒸馆水把药物溶解，再用1%普鲁卡因溶液使成2.5%5%溶液，缓慢肌肉注射，或将药物溶于50%的葡萄糖液内，使成2%的溶液，作静脉注射，每u一次，每次if1J垃为23mg/kg，总剂量为85mg/kg左右。芳香双脉剂在水溶液内不稳定，容易变质增加毒性，每次注射都必须用新鲜溶液。C2 对症治疗C2. 1 贫血患者自口有中等度贫血，在治疗期间应给予铁剂严重贫血者，除给予铁
27、剂外，可进行小量多次输血千辛贫I且有所好转后再用锦剂治疗。山二GB 1 5 9 8 6 -1 9 9 5 c2. 2 鼻出血z先洗净鼻腔，寻找出血点，然后用棉花浸以1 1 000肾上腺素液、3%麻黄素置流血处或用明胶海绵覆盖在出血部位。C3 一般治疗病人在治疗期间，应卧床休息，预防感冒，给予营养丰富和高热量的食物，如鸡蛋、猪肝、豆腐等，每日口服足量的多种维生素，以利病体的恢复。C4 并发症的处理C4. 1 肺炎z并发肺炎的病人，不宜使用镑剂或芳香双眯类药物治疗。肺炎若发生在抗黑热病治疗过程中，应立即停止注射，先用抗菌素治疗，待肺炎症状消失后，再用抗黑热病药物治疗C4.2 急性粒细胞缺乏症g应立即用青霉素治疗，以防止继发感染。如发生在锦lf!J治疗过程中，应立即停止使用抗黑热病药物，待症状消失后再用锦剂或芳香双睐类药物治疗。有时黑热病本身也可引起此症，其原因与使用镑剂无关，在此情况下，锦剂的使用不但无害，且能随病情的好转而促使粒细胞回升。C4. 3 走马府2应及早使用青霉素治疗，效果显著，同时按常用方法给予锦剂治疗。C4. 4 对心、肝或肾有较严重疾患者，宜慎用镑剂，并给予对症治疗。附加说明：本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准由中国预防医学科学院寄生虫病研究所负责起草。本标准主要起草人瞿靖琦、管立人本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。3iln
