1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂Microbiological examination of food hygiene Stainning methods ,culture mediums and reagents 1 主题内容与适用范围本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2染色液配制及染色法2. 1 美蓝染色法2. 1. 1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0. 3 g 95%乙醇30 mL o. 01%氢氧化梆溶液100 mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化何溶液混合。2. 1. 2 染色法将涂片在火焰上固定，待怜。
2、滴加染液，染13min，水洗，待干，镜检。2. 1.3 结果菌体呈蓝色。2.2 革兰氏染色法2. 2. 1 结晶紫染色液结晶紫1 g 95%乙醇20 mL 1%草酸钱水溶液80 mL 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。2.2.2革兰氏碗液破1g 映化饵Zg 蒸馈水300 mL GB 4 7 8 9. 2 8 94 代替GR4789. 28 84 将腆与碗化御先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸缩水至300mLo 2.2.3 沙黄复染液沙黄0. 25 g 95%乙醇10 mL 蒸馈水90 mL 中华人民共和国卫生部199403-18批准1994 09 01实施27
3、6 GB 4 789. 28 94 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。2.2.4 染色法2. 2. 4. 1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2. 2. 4. 2滴加革兰氏破液，作用1min，水洗。2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s. 2. 2. 4. 4 水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2. 2. 5结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注z亦可用l 10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s. 2. 3耐酸性染色法（霎倪二氏法）2. 3. 1 石炭酸品红
4、染色液碱性品红0. 3 g 95%乙醇10 mL 5%盼水溶液90 mL 将品红溶解于乙醇中，然后与盼溶液混合。2. 3. 2 3 %盐酸乙醇浓盐酸3 mL 95%乙醇97 mL 2. 3. 3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。2. 3. 4 染色法2.3.4. 1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。2. 3. 4. 2 滴加盐酸乙醇脱色，直至无红色脱落为止（所需时间视涂片厚薄而定，一般为13min），水洗。2. 3. 4. 3 滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s 1 min，水洗，待干，镜
5、检。2. 3. 5 结果耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4 柯氏染色法2. 4. 1 染色液2. 4. 1. 1 0. 5 %沙黄液。2. 4. 1. 2 0. 5 %孔雀绿液。2.4.2 染色法2. 4. 2. 1 将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约23min ，水洗。2.4.2.2滴加0.5%孔雀绿液，复染4050s.水洗，待干，镜检。2. 4. 3结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。2.5奥尔特氏芙膜染色法2.5. 1 染色液ti黄3g蒸馆水100 ml, 用乳钵研磨溶解。2. 5.2 染色法277 GB 4789. 28-94 将涂片在
6、火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3mino水洗，待干，镜检。2. 5.3 结果炭瘟芽胞杆茵茵体呈赤褐色，英膜呈黄色。2.6瑞氏染色法2. 6. 1 染色液瑞氏色素0. 1 g 甲醇60 mL 用乳钵研磨溶解。2. 6. 2染色法2.6.2. 1 涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定lmin。2. 6. 2. 2 加入等量蒸饱水（pH6.5），染色35mino 2. 6. 2. 3 用蒸馆水冲洗，待干，镜检。2. 7鞭毛染色法2. 1. 1 染色液的配制2.1.1.1 甲液z称丹宁酸5g、氯化高铁（FeCl,)l.5 g，溶于lOOmL蒸馆水中，待溶解后加入1%的氢氧化纳溶液lm
7、L和15%的甲醒榕液2mL。2. 7. 1.2 乙液z称2g硝酸银溶于100m L蒸馆水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化镀溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心）。滴加氮氧化镀和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，23d.基本无效。2. 1.2染色法在风干的载玻片上滴加甲液，46min后，用蒸馆水轻轻神净。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加热时注意勿使出现干燥面）在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2.8碱性笙红染色法将0.
8、5 g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中，然后用蒸馈水稀释至JOOmL。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用注2丰染色液矗用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞轩菌相区别3生化试验培弊基和试1!1J3. 1 Hugh Leifson培弊摹（0/F试验用3. 1. 1 成分蛋白陈2g 氯化纳5g 磷酸氢二御0. 3 g 琼脂葡萄糖。2%澳麟香草盼蓝溶液蒸馆水pH7. 2 3. 1. 2制法4g 10 g 12 mL 1 000 mL 将蛋白胀和盐类加水溶解后，校正pH至7.2。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。海匀后，分装试管，121高压灭菌15min
9、，直立凝固备用。278 GB 4789. 28 94 3. 1. 3试验方法从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约lcm，于36士1培养。3. 1. 4 结果反应类型发酵型（F)氧化型（0)产碱型AJ3. 2糖发酵管3. 2. 1 成分牛肉膏蛋白陈氯化纳磷酸氢二销（Na,HPO, 12H,0) o. 2%澳麟香草盼蓝溶液蒸馆水pH7. 4 3.2.2 制法封口的培养基产酸5g 10 g 3g 2g 不变不变12 mL 1 000 mL 开口的培养基产酸产酸不变3.2.2. 1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，
10、分装于有一个倒胃小管的小试管内，121高压灭菌15min J.2.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL,121高压灭菌15min.另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100ml，培养基内，以无菌操作分装小试管。注zlW糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。3. 2. 3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36士ic培养，一般观察23d，迟缓反应需观察1430d。3. 3 ONPG培养基3. 3. 1 成分邻硝基盼D半乳糖管ONPG)(0 Nitrophenyl /3-D-galactopyranoside) 0. Olmol
11、/L磷酸纳缓冲液（pH7.5) 1%蛋白陈水（pH7.5) 3. 3. 2 制法60 mg 10 mL 30 mL 将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白陈水，以过滤法除菌，分装于10mm 75 mm试管，每管O. 5 ml，用橡皮塞塞紧。3. 3. 3 试验方法自琼腊斜面上挑取培养物1满环接种，于36土1培养l3h和24h观察结果。如果自半乳糖背酶产生，则子l3h变黄色，如无此酶则24h不变色。3.4 缓冲葡萄糖蛋白陈水（MR和VP试验用）3.4. 1 成分磷酸氢二梆5 g 多陈7 g 279 GB 4 789. 28-94 葡萄糖蒸馆水5g 1 000 mL pH7. o 3.4.2 4司法溶化
12、后校正pH，分装试管，每管1mL,121高压灭菌15min。3. 4. 3 甲基红（MR）试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于36士1c培养25d，哈夫尼亚菌则应在2225培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法210 mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸饱水。3. 4. 4 V-P试验用琼腊培养物接种本培养基中，于36士1培养24d。哈夫尼亚菌则应在2225培养。加入6%荼盼乙醇溶液0.5 mL和40%氢氧化饵溶液o.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36士l下培养4h再进行
13、观察。3.5 西藏氏拧糠酸盐培养基3. 5. 1 成分氯化销5 g 硫酸续（MgSO 4 7H20) 磷酸二氢镀磷酸氢二御拧橡酸销琼脂蒸馆水0. 2%澳麟香草酸蓝溶液pH6. 8 o. 2 g 1 g 1 g Jg 20 g 1 000 mL 40 mL 基管t捎酣t 分长后生匀啤均币合才混面剂斜示者指性入阳mM 力果后士”然寨。现面化无斜溶每成放时d如HN4晶。n b酌养，m川川盆口Rd 闷CE。如l菌再士灭H。MM压P面lu高正斜刁此校成种EEEdohh放接基EUhhEEMMUM物养30队0156巳1悔自刊M恃峭段削挥5扯啤MM液装即配唯时包制脚御睛品川柑瞅瞅她姐姐附时酬糖阔脚1纳唰水撇叩
14、向市将高LU取转克橡萄母盐酸化rE脂馈骨热2先3挑色1拧葡酵单磷氯队琼蒸2加EIE绿66。4in气qdtiqJHNM可uq3叫280 GB 4789.28 94 3. 6. 3 试验方法用琼脂培养物接种整个斜面，在36土1培养7d，每天观察结果。阴性者培养基变为红色。3. 7 丙二酸制培郭基3. 7. 1 成分酵母浸膏1 g 硫酸镀2g 磷酸氨二饵0. 6 g 磷酸二氢梆0. 4 g 氯化纳2g 丙二酸销3g 0. 2%澳廓香草酸蓝溶液12 mL 蒸馆水1 ooo mL pH6. 8 3. 7.2 制法先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121高压灭菌15min0 3
15、. 7. 3试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36士1培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.8 葡葡糖镀培养基3. 8. 1 成分氯化饷5 g 硫酸镶（MgSO, 7H,0) 磷酸二氢镀磷酸氢二饵葡萄糖琼腊蒸馆水0. 2%澳廓香草盼蓝溶液pH6. 8 3.8.2 制法0. 2 g 1 g 1 g 2g 20 g 1 000 mL 40 mL 先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121高压灭菌15min，放成斜面。3. a. 3试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20
16、100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36土l培养24h.阳性者葡萄糖镀斜面上有正常大小的菌落生长g阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖镀斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注z容器使用前应用清洁液浸泡再用清水、蒸馆水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果3.9 马尿霞销培弊基J3. 9. 1 成分马尿酸纳1 g 肉浸液100 mL 3. 9. 2 司司法281 GB 4789. 28-94 将马尿酸纳溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭菌1
17、2120 min 3. 9. 3 试剂二氯化铁（FeCl, 6H,CJJ12 g，溶于2%盐酸溶液100mL中即成。3. 9. 4 试验方法用纯培养物接种，于42c培养48h，观察培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馆水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液o.8 mL，加入三氯化铁试剂。.2 mL，立即混合均匀，经1015min, 观察结果。3. 9. 5结果出现恒久之沉淀物为阳性。3. 10 营养明胶3. 1 o. 1 成分蛋白陈5 g 牛肉肾3日明胶120 g 蒸馆水1 000 mL pH6. 8 7.0 3. 10. 2制法加热溶解、校正至pH7.4 7. 6，分装小管，121高压
18、灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.87.0。3. 10.3试验方法用琼脂培养物穿刺接种，放在2225培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在36土1培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。3. 11 苯丙氨酸培养基3. 11. 1 成分酵母浸膏3 g J)J苯丙氨酸（或J，苯丙氨酸1g) 2 g 磷酸氢工纳1 g 氧化纳5日琼脂12 g 蒸饵水1 ooo mL 3. 11. 2制法加热溶解后分装试管，121c高压灭菌15n1in，使成斜面。3. 11. 3 试验方法自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，在36土l培养4h或1824ho i商加10%
19、二氯化铁溶液23滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。3. 12 氨基酸脱援酶试验培养基3. 12. 1 成分蛋白豚5日酵母浸仔3 g 葡萄糖1 g 蒸偏水1 000 mL . 6 ；淡币四世紫乙醇溶液L氨基酸戎J)L一氨基酸282 1 mL 0. 5或1g/100 mL GB 4789. 28 94 pH6. 8 3. 12. 2 制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100rnL，分别加入各种氨基酸z赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L氨基酸按0.5%加入，DL氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5 ml，上面滴加一层液体石
20、蜡，115c高压灭菌10rnin0 3. 12. 3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36士IC培养1824h，观察结果。氨基酸脱竣酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者元碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。3. 13 蛋白陈水（艘基质试验用）3. 13. 1 成分蛋白豚（或膜蛋白脉）20 g 氯化销5g 蒸馆水1 000 rnL pH7. 4 3. 13. 2 制法按上述成分配制，分装小试管，121高压灭茵15rnino 3.13.3能基质试剂3.13.3.1 柯凡克试剂将5g对二甲氨基苯甲醒溶解于75rnL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。3. 13. 3.
21、 2 欧波试剂将lg对二甲氨基苯甲M溶解于95rnL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20 mLo 3. 13. 4 试验方法挑取小量培养物接种，在36土1培养12d，必要时可培养45d。加入柯凡克试剂约0.5 mL, 轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧波试剂约0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注蛋白陈中应古有丰富的色氨酸。每批蛋白腺买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。3. 14 硫酸亚铁琼脂（硫化氢试验用）3. 14. 1 成分牛肉膏3g 酵母浸膏3g 蛋白陈10 g 硫酸亚铁0. 2 g 硫代硫酸锅。.3 g 氯化销5 g 琼脂12 g 蒸馆
22、水1 000 mL pH7. 4 3. 14.2 1剧法加热溶解，校正pH，分装试管，115高压灭菌15min，取出直立候其凝固。3. 14. 3 试验方法挑取琼脂培养物，沿管壁穿刺，于36土l培养12d，观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。注2肠杆菌科细菌测定硫化氢的产生，应采用三糖铁琼脂或本培养基。3. 15 尿素琼脂3. 15. 1 成分283 GB 4789 28-94 蛋臼陈1 g 氯化销5g 葡萄糖1 g 磷酸二氢御2g 0.4%盼红溶液3 mL 琼旨20 g 蒸馆水1 ooo mL 20%尿素溶液100 mL pH7. 2士0.1 3. 15. 2制法将除尿素和琼脂以外的成分配
23、好，并校正pH，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121高压灭菌15 mino冷至5055，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2士o.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。3. 15. 3试验方法挑取琼脂培养物接种，在36土1培养24，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。J. 16 .化悍（KCN）培养基3. 16. 1 成分蛋白陈氯化销磷酸二氢绑磷酸氢二纳蒸馆水0. 5%氟化饵溶液pH7. 6 3. 16. 2制法10 g 5 g o. 225 g 5. 64 g 1 000 mL 20 mL 将除氟化僻以外的成分配好后分装烧瓶，121高压灭菌15min
24、。放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL培养基加入0.5%银化御溶液2.o mL（最后浓度为l 10 000），分装于12mm00 mm灭茵试管，每管约4mL，立刻用灭茵橡皮塞塞紧，放在4冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氟化钢的培养基作为对照培养慕，分装试管备用。3. 16. 3试验方法将琼脂培养物接种于蛋白陈水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氧化饵（KCN）培养基并另挑取l环接种于对照培养基。在36士1培养12d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。注2氧化饵是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行试验失败的主要原因
25、是封口不严，氟化梆逐渐分解，产生氢佩酸气体逸出，以致药物被度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意3. 17硝酸盐培弊基3. 17. 1 成分硝酸例。.2 g 蛋白5 g 蒸馆水l 000 mL pH7. 4 284 GB 4789. 28 94 3. 17.2制法溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL,121高压灭菌15min0 3. 17.3硝酸盐还原试剂3. 17.3. 1 甲液z将对氨基苯磺酸。.8 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100mL中。3. 17.3.2 乙液将甲荼胶0.5 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100mL中。3. 17.4 试验方法接
26、种后在36士1培养l4d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。注2丰试验阴性的原因有：细菌不能还原硝酸盐e亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮g培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入铸粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色3. 18氧化酶试验3. 18. 1 试剂3. 18. 1. 1 1 %盐酸二甲基对苯二胶溶液z少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。3.18.1.2 1%荼盼乙醇溶液。3. 18. 2 试验方法3. 18. 2. 1 取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胶溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加a荼盼榕
27、液漓，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。3. 18. 2. 2 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。3. 19细胞色素氧化酶试验3. 19. 1 试剂3. 19. 1. 1 1 %盐酸二甲基对苯二胶溶液。3.19.1.2 1%荼盼乙醇溶液。3. 19. 2试验方法取37c或低于37）培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各23滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。3.19.3结果于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应
28、均作为阴性结果。3.20过氧化氢酶试验3. 20. 1 试剂3%过氧化氢溶液：I脑用时配制。3. 20. 2 试验方法挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。3. 20. 3结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。3. 21 过氧化物酶试验3. 21. 1 试剂3. 21. 1. 1 2 %儿茶勘溶液。3.21.1.2 3%过氧化氢溶液。3.21.2试验方法挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加2%儿茶酣溶液lmL及3%过氧化氢溶液lmL。静置于室温（20）中3060min，观察结果。3. 21. 3结果285 GB 4 7
29、8 9 2 8 9 4 阳性反应，细菌变为黑褐色；阴性反应，细菌不变色。注过氧化物酶的作用可受氟化饵的抑制。3.22 磷酸盐缓冲液3. 22. 1 储存液磷酸二氢御1 mol/L氢氧化纳溶液蒸馆水pH7. 2 3. 22. 2制法34日175 mL 825 mL 先将磷酸盐溶解于500mL蒸馆水中，用1mol/L氢氧化销溶液校正pH后，再用蒸饱水稀释至1 000 ml, 3. 22. 3 稀释液取储存液1.25 mL，用蒸饱水稀释至1000 mL，分装每瓶100mL或每管10mL, 121高压灭菌15min, 3.23明胶磷酸盐缓冲液3.23. 1 成分明胶2g 磷酸氢二销4g 蒸馆水1 00
30、0 mL pH6. 2 3. 23-2 制法加热溶解，校正pH,121高压灭菌15min, 3. 24乳酸苯19溶液3. 24. 1 成分苯盼乳酸（比重1.21) 甘泊蒸馆水3.24.2 4司法10 g 10 g 20 g 10 mL 将苯盼在水中加热溶解，然后加入乳酸及甘泊。3.24.3 用途检验真菌形态时用。4 般培养基和专用培养基4. 1 肉漫液肉汤4. 1. 1 成分绞碎牛肉氯化纳286 500 g 5日蛋白陈磷酸氢二饵蒸馆水4. 1. 2 iliJ法GB 4789. 28 94 10 g 2g 1 ooo mL 将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馆水1000 ml，混合后放冰箱过夜
31、，除去液面之浮泊，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白陈、氯化销和磷酸盐，潜解后校正pH7.4 7. 6煮沸并过滤，分装烧瓶，121高压灭菌30min。4.2 肉漫液琼脂4. 2. 1 成分肉浸液肉汤（pH7.4) 琼脂4. 2. 2制法1 000 mL 17 20 g 加热溶化琼脂，分装烧瓶或试管，121高压灭菌30mino根据需要，倾注平板或放成斜面。4. 3牛肉（或牛心）消化汤4. 3. 1 成分绞碎牛肉（或牛心）15%氢氧化销溶液膜蛋白酶一氯甲烧氯化饷蒸馆水4.3.2 制法1 000 g 27 mL 40 mL 1 mL 10 g
32、2 000 mL 4.3.2. 1 称取碎牛肉，加蒸馆水，隔水加热到80，维持15min。4.3.2.2 加氢氧化销溶液，对pH试纸呈弱碱性，冷至40。4. 3. 2. 3加膜蛋白酶、氯仿，在36士1放置45h，每小时摇动一二次，4. 3. 2. 4 4 h后，吸取上层液5mL于试管中，加5%硫酸铜溶液。.1 mL、4%氢氧化制溶液5mL，混合之。若呈红色，则不须再消化，可由温箱取出。4. 3. 2. 5 加入15%乙酸溶液45mL，对pH试纸呈酸性。4.3.2.6煮沸15min，使膜蛋白酶破坏，冷后，放冰箱内一夜。4. 3. 2. 7 次日吸取上层清液，加氯化销10g，并加水补足原量，煮沸。
33、4. 3.2.8 校正pH7.47.6（加15%氢氧化销溶液约10mL），加热，用滤纸过滤，分装烧瓶，121高压灭菌20min。注z此培养基可作为琼脂培养基的基础，不需加蛋白陈，膜蛋白酶之配制称取去脂绞碎的猪膜soog,Jm入乙醇500mL、蒸锢水1500mL，混合之，装入玻塞瓶内。每日摇匀三次。3d后，用绒布过滤挤出其汁，加盐酸至0.05%，放冰箱内保存备用。4.4血消化汤4.4. 1 成分287 绞碎猪胃绞碎猪血块蒸馆水浓盐酸4, 4, 2 制法GB 4789 28-94 100 g 100 g 1 000 mL 10 mL 4,4.2.1 洗涤猪胃，除去油脂，保留胃粘膜，用绞肉机绞碎。4
34、.4.2.2 用绞肉机将猪血块绞碎。4. 4. 2. 3将蒸馆水加热至55，加入猪胃、猪血块和盐酸，置55水浴中24h，时常加以摇动。4,4.2.4 从水浴内取出，加入1moL/L碳酸销溶液5mL，煮沸10min，置于冰箱内一夜。4,4.2.5 吸取上层清液，加磷酸氢工饵1g，加热至75，加入1mol/L碳酸销溶液45mL，煮沸，校正pH7. 2 7, 4o 4, 4, 2. 6 用滤纸过滤，分装烧瓶，121高压灭菌20mino 注z本培养基不吉糖可供作鉴别培养基之基础，不需加蛋白陈和氯化销( l mol/L碳酸纳溶液之配法无水碳酸销10.6 g，溶于1ooo mL蒸馆水中4, 5 豆粉琼脂4
35、, 5. 1 成分牛心消化汤（pH7.4 7. 6) 琼脂黄豆粉混液4. 5. 2 制法1 000 mL 20 g 50 mL 将琼腊加在牛心消化汤内，加热洛解，过滤。加入豌豆粉浸液，分装每瓶100mL,121高压灭菌15 min 4, s. 2, 1 豌豆粉浸液制法取豌豆粉5g、氯化销10g，加入蒸馆水lOOmL。置100水浴内加热1h. 放于冰箱中过夜。吸取上清液JlP为豌豆浸液。4.6血琼脂4. 6. 1 成分pH7. 4 7. 6豆粉琼腊100 mL 脱纤维羊血（或兔血）5 10 mL 4.6.2 4司法加热溶化琼脂，冷至50，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平极。亦可分装灭菌试管
36、，置成斜面。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。4, 7营养琼脂4. 7. 1 成分288 蛋白腺牛肉膏氯化纳琼脂10 g 3g 5自15 20 g 蒸馆水4. 7. 2 4司法GB 4789. 28-94 1 000 mL 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馆水内，加入15%氢氧化纳溶液约2mL，校lpH至7.2 7. 4 0 加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121高压灭菌15min。注z此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面如用于菌落计数，琼脂量为1.5%；如作成平板或斜面，则应为2%.4.8曹弊肉汤4. 8. 1 成分蛋白陈牛肉膏氯化销蒸馆水4. 8. 2 fl国j
37、法10 g 3g 5日1 000 mL pH7. 4 按上述成分混合，溶解后校正pH，分装烧瓶，每瓶225mL, 121高压灭菌15min. 4. 9乳糖胆盐发酵管4. 9. 1 成分蛋白腺猪胆盐（或牛、羊胆盐）乳糖。.04%澳甲盼紫水溶液蒸馆水pH7. 4 4.9.2 制法20 g 5g 10 g 25 mL 1 000 mL 将蛋白脉、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115高压灭菌15min. 注z双料乳糖胆盐发酵管除蒸熠水外，其他成分加倍4. 10 乳糖发酵管4. 1 o. 1 成分蛋白陈乳糖0. 04%澳甲盼紫水溶液蒸馆水pH7. 4 4.
38、 1 o. 2制法20 g 10 g 25 mL 1 000 mL 将蛋白陈及乳糖溶于水中，校正pH,!JU入指示剂，按检验要求分装30mL、10ml，或3mL，并放入一个小倒管，115c高压灭菌15min. 289 GB 4 7 8 9 2 8 9 4 注双料乳糖发酵管除蒸馆水外，其他成分加倍( 30 mL和10mL乳糖发醇管专供酱油及酱类检验用，3tnL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用4. 11 EC肉汤4. 11. 1 成分膜蛋白陈20 g 3号H！盐（或混合胆盐1. 5 g 乳糖5 g 磷酸氢二饵4g 磷酸二氧铮1. 5 g 氯化纳Sg 蒸馆水1 000 mL 4. 11.2制法将上述成
39、分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121离压灭菌15min，最终pH为6.9土0.2. 4. 12缓冲蛋白陈水（BP)4. 12. 1 成分蛋白底氯化销磷酸氢二销（Na,HPO, 1ZH20) 磷酸二氢惆蒸饱水4. 12.2制法pH7. 2 10 g 5g 9g 1. 5 g 1 000 mL 按上述成分配好后以大烧瓶装，121高压灭菌15min，临用时无菌分装每瓶225mL。注本培养基供抄门氏菌前增菌用4. 13氯化镶孔雀绿增菌液（MM)4. 13. 1 甲液膜蛋白陈Sg 氯化销Sg 磷酸二氢铮蒸馆水4. 13-2 乙液氯化候（化学纯）蒸偏水4. 13. 3 丙液o. 4%孔雀绿水溶液
40、。290 1. 6 g 1 000 mL 40 g 100 mL GB 4789. 28-94 4. 13. 4制法分别按上述成分配好后，121高压灭菌15min备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL、丙液o. 9 mL以无菌操作混合即可回注术培养基亦称R叩papott!O(R，.）增菌液。4. 14 四硫磺酸铀煌缭增菌液（TTB)4. 14. 1 基础培养基多陈或际陈5g 胆盐1 g 碳酸钙10 g 硫代硫酸纳蒸馆水4, 14.2腆溶液碗碗化饵蒸馆水4, 14. 3制法30 g 1 000 ml, 6g 5日20 mL 将基础培养基的各成分加入蒸馆水中，加热溶解，分装每瓶100mL0分装时应
41、随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。121高压灭菌15min备用。l脑用时每100mL基础培养基中加入碳溶液2ml，、0.1%熄绿溶液1mLo 4. 15 四硫磺酸销煌绿增菌液（换用方法）, 4. 15. 1 基础液蛋白陈10 g 牛肉骨5g 氯化纳3日碳酸钙45 g 蒸馆水1 000 mL 将各成分加入于蒸馆水中，加热至约70溶解，校正pH至7.0士0.1.121c高压灭菌20mino 4, 15. 2硫代硫酸销溶液硫代硫酸纳（Na,S,O, 5H,0) 蒸锢水4, 15. 3 腆溶液确片腆化何蒸饱水20 g 25 g 加至100mL 50日加至100mL 将碗化何充分溶解于最少量的蒸馆水中，加入
42、硕片，振摇玻瓶豆腆片全部溶解，再加入蒸锵水至规291 定量。贮于棕色玻瓶内，紧塞瓶盖备用。4. 15.4煌绿水溶液熄绿蒸馆水GB 4 789. 2894 0. 5 g 100 mL 存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。4. 15.5 牛胆盐榕液干燥的牛胆盐蒸馆水煮沸溶解，121高压灭菌20mino 4. 15.6制备基础液硫代硫酸钩溶液殃液煌绿溶液牛胆盐溶液10 g 100 mL 900 mL 100 mL 20 mL 2mL 50 mL i临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入于基础液中，每加入种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。分装于灭菌瓶中，每瓶100mL。4. 16亚砸酸盐眈氨醺增菌液
43、侣。4. 16. 1 成分蛋白陈乳糖亚晒酸氢饷磷酸氢二纳磷酸工氢饵L胧氨酸蒸饱水5g 4g 4g s.;5 g 4. 5 g o. 01 g 1 000 mL 4.16.2 1%L脱氨酸氢氧化纳溶液的配法z称取L胧氨酸。.1 g（或DL胧氨酸0.2 g），加1mol/L氧氧化纳1.5mL，使溶解，再加入蒸馆水8.5 mL JlP成4. 16.3 制法将除亚硝酸氢纳和L脱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馆水中，加热煮沸，像冷备用。另将亚硝酸氢销溶解于100mL蒸馆水中，加热煮沸，侠冷，以无菌操作与上掖混合。再加入二胧氨酸氮氧化纳草草液1mL.分装于灭菌瓶中，每瓶100mL,pH应为7.0士0.
44、10 4. 17 GN糟菌液4. 17. 1 成分自费蛋白陈20 g 葡萄糖1 g 292 GB 4789. 28-94 甘露醇2g 拧橡酸销5 g 去氧胆酸销0. 5 g 磷酸氢二御4g 磷酸二氢御1. 5 g 氯化纳5 g 蒸销水1 000 mL pH7. o 4. 17. 2 4司法按上述成分配好，加热使溶解，校正pH。分装每瓶225mL,115高压灭菌151nin, 4. 18肠道菌增菌肉汤4. 18. 1 成分蛋白陈10 g 葡萄糖5 g 牛胆盐20 g 磷酸氢二销8g 磷酸二氢饵2g 煌绿0. 015 g 蒸馆水1 000 mL pH7. 2 4. 18. 2制法按上述成分配好，加
45、热使溶解，校正pH。分装每瓶30mL,115高压灭菌15min, 4. 19亚磺酸锚琼脂（BS)4. 19. 1 成分蛋白陈10 g 牛肉膏5 g 葡萄糖5 g 硫酸亚铁0. 3 g 磷酸氢二纳4g 煌绿0. 025 g 拧镣酸锁镀2g 亚硫酸销6g 琼腊18 20 g 蒸馆水1 000 mL 293 GB 4789.28二94pH7. 5 4, 19. 2 制法4. 19. 2. 1 将前面5种成分溶解于300mL蒸馆水中。4. 19. 2. 2将拧橡酸铅接和亚硫酸俐另用50mL蒸馆水溶解。4. 19.2.3将琼脂于600mL蒸馆水中煮沸溶解，冷至804.19.2.4 将以上三液合并，补充蒸
46、倒水至1OOOmL，校正pH，加0.5%煌绿水溶液5mL，摇匀。冷至5055，倾注平皿。注此培养基不需高压灭菌。制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性。应在临用前一天Jlj!J备，贮存于室温暗处。超过48h不宜使用。4. 20 DHL琼脂（DeoxycholateHydrogen Sulfide Lactose Agar) 4. 20. 1 成分蛋白豚20日牛肉膏3g 乳糖10 g 庶糖10日去氧胆酸纳1 g 硫代硫酸纳2. 3 g 拧棱酸纳1 g 拧橡酸铁锁1 g 中性红0. 03 g 琼脂18 20 g 蒸馆水1 ooo mL pH7. 3 4.20.2 制法将除中性红和琼脂以外的成分溶解
47、于400mL蒸馈水中，校正pH。再将琼脂于600mL蒸馆水中煮沸溶解，两液合并，并加入0.5%中性红水溶液6mL，待冷至5055，倾注平板。4. 21 HE琼脂（HektoenEnteric Agar) 4.21. 1 成分294 际陈牛肉膏乳糖直在糖水杨素胆盐氯化销琼脂12 g 3 g 12 g 12 g 2g 20 g 5 g 18 20 g 蒸馆水。.4%澳廓香草盼蓝溶液Andrade指示剂甲液乙液4, 21. 2 4司法pH7. 5 GB 4 7 8 9. 2 8-9 4 1 000 mL 16 mL 20 mL 20 ml, 20 mL 将前面七种成分溶解于400mL蒸馆水内作为基础
48、液，将琼脂加入于600mL蒸惚水内，加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内，校正pHo再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至5055，倾注平板e注2此培养基不可高压灭菌。甲液的配制硫代硫酸销拧攘酸铁镀蒸馆水乙液的配制去氧胆酸销蒸馆水Andrade指示剂酸性复红I mol/L氢氧化锅溶液蒸馆水34 g 4 g JOO mL 10 g JOO mL 0. 5 g 16 mL 100 mL 将重红溶解于蒸馆水中，加入氧氧化纳溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化纳溶液I2mL。4. 22 SS琼脂4, 22. 1 基础培养基牛肉膏月示陈三号胆盐琼脂蒸馆水5g 5g 3. 5 g 17 g 1 000 mL 将牛肉膏、麻炼和胆盐溶解于400mL蒸馆水中，将琼脂加入于600mL蒸馆水中，煮沸使其溶解，再将两液混合，121高压灭菌15min，保存备用。4.22.2完全培养基基础培养基1 000 mL 乳糖10 g 拧橡酸销s. 5 g 295 硫代硫酸纳10%拧穰酸铁溶液1%中性红溶液GB 4789-28 94 8. 5 g 10 mL 2. 5 mL 0.1%煌绿溶液0. 33 mL 加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀，校正至pH7.。，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。注21ilJ好的培养基宜
