1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法Microbiological examination of food hygiene Examination。fSalmonellae ,Shigellae, and diar ca us旧iveEscherichi，coli by means。fthe d阳gn。stictyping phage set for enterobacterlaceae 1 主题内容与适用范围GB 4789. 31-94 本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要
2、求、操作程序和结果判定。本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的炀道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。2 引用标准GB 4789. 4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB 4789. 5食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB 4789. 6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3. 1 温箱：“土1。3. 2 水平仪。3. 3灭菌平皿，gomm 15 mmo 3. 4 定量滴管z每滴约10Lo用输液用的玻璃接管配4号针头，灭菌。3. 5橡皮乳头。3.6 灭菌棉签。3. 7酒精灯。3.8接种棒，镇锵丝。3.
3、9试管架。4 培养基和试剂4. 1 营养琼脂、营养肉汤按GB4789. 28中3.7和3.8进行。中华人民共和国卫生部199403 18批准1994-09-01实施333 GB 4789. 31-94 4.2 蛋白脐、水、能基质试剂按GB4789. 28中2.13进行。4. 3 三糖铁琼脂按GB4789. 28中3.24和3.25进行。4.4 肠杆菌科诊断用噬菌体，7种和3种。安瓶启开后用无菌毛细吸管吸出移入灭菌小试管内，用无菌胶塞塞紧，放于4冰箱备用。5 检验程序5. 1 肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序见图1: 检样前增菌、增菌和分离，按GB4789. 4 挑取可疑菌曹噬菌体试验TS
4、！（斜面、底层、产气、H,SJ 盖自陈革（自由基质）尿素CpH7.剖，KCN，赖氨酸0 1裂解非如左述的各种噬菌体其他均不裂解各种裂解结果均不裂解H, S，援基质一，H, S十，童基质，H, S ，障基质一非如左述的！章一，KCN-,尿素,KCN-, 尿素一，KCN, 各种反应结果赖氨酸十赖氨酸赖氨酸甘露醇、山梨酣ONPG ，十, + 渺门氏菌非抄门氏菌静门氏菌沙门氏菌非抄门氏菌非性门氏菌血清学试监血清学试验血清学试验报告图l肠杆菌科诊断用噬菌体检验ti门氏菌的程序334 GB 4789. 31-94 5.2肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序见图2:Sh裂解，并呈现各种裂解模式血清学试验与
5、裂解模式相符且被IRTD Sh裂解生业分群试验在贺民菌属分群及分型结果检样增菌和分离按GB4789. 5 挑取可疑菌落TS！葡萄糖半固体TS！底层产酸，斜面产瞩，H,s一不产气，无动力咀菌体试验血糟学试验与裂解模式不相符或不被IRTD Sh裂解葡萄精镀试验Jl要时加做L酸纳直氏拧穰酸盐帖液酸、七叶昔、本杨曹试验葡萄糖镀或任何其他阳性结果非志贺氏菌报告Sh不裂解非事贺氏菌图2肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序非如左述的各种反应结果非志lll氏菌. 335 GB 4789. 31 94 5. 3 肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序见图3,检样增商和分离，按GB4789. 6 乳精:
6、It酵或不发酵的菌蕾35个崛菌体试瞌E和或Sh、E4 E和或Sh、E-4 各种幢菌体均不裂解噬菌体本裂解，醺菌体裂解氧化离.G轩菌骂他咂菌体裂解不同来源分离的菌株T饵，能基匮其裂解模式pH7. 2尿章，KCN.具有同一性赖氨酸，动力TSI底层非如左璋的H,S ,KCN一各种反应结果尿章血清掌试脸ETEC+ EPEC或EIEC+ 非如左述的EHEC(0!57) 各种反应结果赖组酸一幢矗质，动力一（0124动力腼毒草非大肠产腼毒章大肠道致病性或腼道侵亵性非致泻大非大局肠道出血性埃希氏菌肠埃希民菌大腼埃希氏菌肠埃希氏菌埃希氏菌大肠埃希民菌报告图3肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序6检验步
7、骤6. 1 前增菌、增菌和分离6. 1. 1 沙门氏菌的前增菌、增菌和分离，按GB4789. 4进行。336 GB 4789. 31 94 6. 1. 2 志贺氏菌的增菌和分离，按GB4789. 5进行。6. 1.3致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离，按GB4789. 6进行。6.2 噬菌体试验6. 2. 1 培养基的准备营养琼脂平板（含琼脂1%1.5%，琼脂量视其凝固性而定，约为一般用量的3/4），每个9cm平皿中约25mL，放在水平台面上候其凝固，翻转平板，在36半开皿倒置约1h，以烘干培养基表面水分，并使琼腊具有显著的吸水性。6. 2. 2试验菌液的准备从选择性鉴别平板上挑取菌落，一般应多挑几
8、个菌落，以防遗漏。检验沙门氏菌时，不但应挑取乳糖阴性产H,S和不产H,S的菌落，还应挑取乳糖阳性产H,S的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳性或阴性的菌落35个。检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半团体管，于36培养过夜，次日选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产H,S，不产气元动力的培养物。下述两种方法可供选用。6. 2. 2. 1 一法：将待试菌落接种于营养肉汤管内，于36培养过夜。挑取此肉汤培养物一满环，稀释于一管盛有12mL的蛋白陈水试管内，使成为1 200 1 : 400稀释菌液，含菌量约为110/ml,o 6. 2. 2. 2 二法z用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌
9、落，挑取菌量不宜过多，稀释于一管盛有12mL蛋臼陈水试管内，使其含菌量约与一法相似。6.2.3 涂抹试验菌液6. 2. 3. 1 斑点涂抹法z将营养琼脂平板表面自圆心起分为三等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每挑取试验菌液满环，涂抹直径约1cm的菌斑一个。每株培养物涂抹7个菌斑，外圄4个，内圈3个。6. 2. 3. 2 棉签涂抹法z用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面二分之一的区域内涂抹。兰个涂抹区之间保持适当距离。略等数分钟，俊菌液干燥。6. 2. 4 滴加噬菌体用定量乳头滴管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴，依次为OI、c、Sh、E、CE、E4和Ent。滴管上安装4号针头
10、，每毫升约为100滴。每支滴管只滴加一种噬菌体，针尖绝对不能接触平板表面，严格防止交叉污染。每用一支滴管，可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。滴加噬菌体时必须将琼脂平板放在水平台面上。待7种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟，待噬菌体液干燥。翻转平板，放36培养56h，并过夜各观察一次结果。如果仅有一两株培养物作噬菌体试验，则可用直径为3mm的接种环挑取噬菌体，依次滴加在菌斑上。灼热的接种环必须完全冷却以后方可挑取噬菌体。6. 2. 5试验结果的判定按表1判定噬菌体试验的结果。必要时吸取少许剩余的蛋自陈水培养物作自童基质试验，大肠埃希氏菌培养物一般为自童基质阳性。表1肠杆菌科噬菌体诊
11、断表噬菌体裂解模式序号判定结果0 I c Sh E CE E-4 Ent 1 CL 沙门氏菌属2 CL CL 沙门氏菌属（自在基质一）大肠旗希氏菌（舵基质十）337 GB 4789. 31 94 续表1肠杆菌科噬茵体诊断表噬菌体裂解模式序号判定结果。Ic Sh E CE E4 Ent 3 CL () () 弗劳地氏拧横酸杆菌CL 志贺氏菌属籍、大肠埃希氏4 . . . 菌5 CL CL . . . 大局埃希氏菌6 . CL . . 大肠埃希氏菌7 CL . 弗劳地氏拧橡酸杆菌、大肠埃希氏菌8 CL 大脑埃希氏菌9 () . CL 阴沟肠杆菌噬菌体阴性菌株（用生化试。验鉴定注，CL融合性裂解不裂
12、解，裂解或不裂解；（很少菌株裂解什结合菌型预测，见表3。6. 2. 6供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法采用如下3种噬菌体a. 沙门氏菌CI噬菌体gb. E多价噬菌体，包括E和Sh; C多价噬菌体，包括C、CE和Ent,培养基和试验菌液的准备均同前法。涂抹试验菌液g斑点涂抹法将琼脂平板表面分为四等份，每等份可供涂抹一株细茵培养物。每株培养物涂抹3个菌斑，外圈2个，内圈1个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹5条菌带。略等数分钟，侠菌斑干燥。依次滴加上述3种噬菌体，在36培养56h，并过夜各观察一次结果。按表2判定简化诊断法的结果。表2三滴法噬茵体试验简化诊断表Cl
13、 T E多价C多价判定结果CL 抄门氏菌属. CL . 大脑埃希氏菌CL 弗劳地氏拧橡酸杆菌噬菌体阴性培养物注zCL 融合性裂解e不裂解，裂解或不裂解s赞包括阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。6.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验有少数的沙门氏菌培养物不被OI噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解。故应将不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂。以下分别按GB4789. 4和GB4789. 6进行。6.4 血清学分型鉴定6.4. 1 沙门氏菌，接GB4789. 4进行。6. 4. 2 致泻大肠埃希氏菌，按GB4789. 6进行。338 GB 4789. 31-94 6.4.3
14、 志贺氏菌6.4. 3. 1 记录噬菌体试验的结果，并按表3判定血清学分型鉴定的方向。Sh噬菌体不裂解的培养物不属于志贺氏菌。已知全部志贺氏菌培养物均能被Sh噬菌体裂解，且将其稀释至1RTD时，有99%的志贺氏菌培养物仍应被裂解。表3噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的方向噬菌体裂解模式志贺氏菌血清学分型序号鉴定的方向OI c Sh E CE E 4 Ent 4-1 CL CL CL CL 福氏1-5，（鲍氏Ill福氏，4，躏疾2，鲍氏4 2 CL CL CL 5, 7, !, 16, 17, （宋内氏I) 4-3 CL CL 宋内氏I，躏疾2，福氏. 4，鲍氏5,16,、4 4 CL
15、CL CL 宋内氏E，褐氏3福氏6.鲍氏14，偶4 5 CL 数型618（除16外），瘸疾3124 6 CL CL 鲍氏9,154 7 CL CL 瘸疾I （宋内氏I) 5 1 CL CL 鲍氏13注，CL融合性裂解s不裂解川）内为罕见的结果。挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集试验。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查。6.4.3.2如按噬菌体裂解模式提示为福氏志贺氏菌15型，可先用福氏多价血清做凝集试验c如果呈现凝集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型（见GB4789. 5表2）。6.4.3.3 如按噬菌
16、体裂解模式提示为福氏6型，鲍氏各型或喇疾312型，可先用福氏6型血清做凝集试验。福氏6型血清不凝集者，可用鲍氏多价血清或病疾312多价血清做凝集试验。如果吴现凝集，再分别用各型因子血清检查。6.4.3.4 如按噬菌体裂解模式提示为宋内氏E相菌而不被宋内氏血清凝集时，可直接按曦菌体裂解模式和粗糙形菌落特征判定之。6.4.3.5 按噬菌体裂解模式所提示的方向做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某个分型因子血清凝集而与噬菌体裂解模式不相符者，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被lRTD的Sh噬菌体裂解者，均应做葡萄糖镀试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖镀试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时还可以做如下的生化试验
17、，即：乙酸纳、克氏拧橡酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶、七叶背的分解试验。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性、宋内氏菌的少数菌株可利用粘液酸，福氏4a型的少数菌株可利用乙酸纳外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。这些试验中任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌。6.4.3.6检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性（见GB4789. 5表3），但福氏6型与A群或C群相似。自童基质阳性的志贺氏菌血清型为荆疾2型、7型和8型，鲍氏5、7、9、11、13、15、16和17型，但339 GB 4789. 31-94 福氏15型的能基质反应较弱；直在基质阴性的志贺氏菌血清型为剩疾1型、36型、912
18、型、福氏6型、鲍氏14,6,8,10,12.14和18型，和宋内氏菌。6. 5大肠埃希氏菌肠毒素试验按GB4789. 6进行。6. 6结果报告6. 6. 1 沙门氏菌检验的结果报告6. 6. 1. 1 0 I噬菌体裂解，其他均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告；或符合上述裂解结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。6.6.1.2各种噬菌体均不裂解，但生化试验确定为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告，或符合上述生化试验结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。6.6.1.3 非如上述的裂解结果，或生化试验否定为沙门氏菌者，可报告为非沙门氏菌。6. 6. 2 志贺氏菌检验
19、的结果报告6.6.2. 1 Sh噬茵体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式相符者，可报告志贺氏菌分型结果。罕见血清型要求被1RTD Sh噬菌体裂解，并符合志贺氏菌生化分群结果。6. 6. 2. 2 非如上述的试验结果均报告为非志贺氏菌。6. 6. 3致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告6. 6. 3. 1 E和或Sh、E4噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有向一性，经血清学分裂确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌（要求有肠毒素试验结果），侵袭性大肠埃希氏菌（要求赖氨酸阴性、动力阴性，但0124亦可为动力阳性），肠道出血性大肠埃希氏菌（限于0157）或肠道致病性大肠埃希氏菌。6.6. 3.2 各种噬菌体均不裂解，经生化试验符合大肠埃希氏菌，并经血清学分型确定者，亦可分别报告各类致泻大肠埃希氏菌，其要求与6.6. 3. 1相同。6.6.3.3非如6.6. 3. 1和6.6. 3. 2结果均报告为非大肠埃希氏菌或非致泻大肠埃希氏菌。340 GB 4789. 31-94 附加说明z本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由江西省卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人何晓青本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。341
