1、中华人民共和国国家标准工业循环冷却水中土壤平皿计数法测定Industrial circulating cooling water-Examination of soil micro-bioti-Standard of plate count 1 主题内容与适用范围本标准规定了工业循环冷却水中土壤菌群的测定方法。G/T 14643.2-93 本标准适用于工业循环冷却水中土壤菌群的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中土壤菌群的测定。2 51用标准GB 603 化学试剂试验方法所用制剂及制品的制备GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要本方法采用混合培养基，利用平皿计数技术，在29
2、土lC培养72h.测定循环冷却水中土壤菌群总数。4 试剂和材料本试验方法中除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB6682中三级水规格的水。4. 1 牛肉青生物试剂;4.2 蛋白陈生物试.1ft;4.3 琼脂z生物试剂;4.4 氯化纳(GB1226); 4. 5 硝酸纳(GB636); 4.6 磷酸氢二御(HG3-1228) 4.7 氯化饵(GB646); 4.8 硫酸续(GB671); 4. 9 硫酸亚铁(GB664);4.10 煎糖(HG3-1001); 4. 11 土壤(果园士、菜园土); 4.12 氮氧化纳(GB629)溶液:40g/L, 4.13 乙醇(GB678)溶液:75%(V/
3、V);4.14 硫代硫酸销(GB637) , 国家技术监督局1993-08-06批准:J I )份1994-07-01实施4.15 牛皮纸:4.16 民用脱脂棉g4.17 医用脱脂纱布。5 仪器和设备常规微生物实验室设备和25. 1 无菌箱(室)或超净工作台，5.2 蒸汽压力灭菌器g5. 3 生化培养箱5GB/T 14643.2-93 5.4 鼓风电热干燥箱z温度可控制在60280:I:2C, 5. 5 铝锅z件200mm;5. 6 搪瓷量杯dOOOmL , 5. 7 磨口三角瓶dOOmL;5.8 培养皿，90mm;5. 9 磨口试剂瓶dOOOmL; 5.10 刻度吸管:lmLj 5. 11
4、刻度吸管:5mL;5.12 王角瓶500mL。6 试验前的准备6. 1 土壤浸出液的制备称取约100g土壤加入300g水中，采用蒸汽压力灭菌器在121士lC灭菌15min.静置24h后第二次欠菌，再静置24h后进行第三次灭菌。瓶中的上层清液为土壤浸出液。6.2 培养基的制备称取下列试弗IJ, 牛肉青，1.5日:蛋白陈5.Og; 氯化纳2.5g; 硝酸纳:2.5Eg磷酸氢二饵20.5gp氯化甲，0.2g; 硫酸续0.25g;硫酸亚铁，0.00!ig，煎糖320.og;土壤浸出液，5mL;琼脂215.Ogo将上述试剂加水约950mL.在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，用热
5、水补充至1OOOmL.用氢氧化纳溶液调节pH至7.0士0.2.并分装在500mL三角瓶中，每瓶分装量不超过其总量的三分之二。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于121土lC灭菌15mino6. 3 元菌稀释水的制备6. 3. 1 生理盐水的配制:称取8.5g氯化销，溶解在1000mL水中，混匀。6. 3. 2 将生理盐水(6.3.1)分装在1OOOmL磨口三角瓶中，每瓶45mL.每个三角瓶塞子和瓶口问插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防、污染，用蒸汽压力灭菌器于121士1C灭菌507 GB/T 14643.2-93 15min。6.4 刻度吸管的灭菌6.4. 1
6、 将洗净并烘干后的吸管粮端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约1015mm，梅花不宜露在口外，多余的棉花可以照火士在烧掉。6.4.2 每支刻度吸管用一条约405Omm策的牛皮纸条，以45左右角度螺旋形搭起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折接打结，不使散开，标上量度，辛苦干支捆成一束，宽电热干燥箱中，于160士2C灭菌泊。6.5 培养路的灭曹雪将洗净并告其子后主专培养路10个左右登在一起，用牛皮纸姥成一筒，登电热干燥箱中子160士Z:灭商2h.6.6 采佯瓶的灭商将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈!:1牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱子160土2C灭葛2人6. 7 硫代硫酸销
7、灭茵将硫代硫酸纳放入无菌稍窒)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，J(商30mino7 测定步骤7.1 水撑的采集7. 1. 1 用无商采样瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和瓶颈，防止这些部分受杂商污染。瓶内要留下足够的空间，以备测定之前摇晃。7. 1.2 若采集的水中有余氯，应予采样前在无菌操作下子无德采样瓶(6.6)中加入灭过茵的硫代硫酸每每(6.7)，JJU入1最为每升水祥约O.lgo7.1.3 水祥采集后应立即进行测定，如果2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于4-10C保存，保存时间不宜翻过24h.经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出于30C左右活化4-仙，再进行测
8、定。7.2 元蕾靠在絮)灭茵7.2. 1 将实验所用的无菌稀释水、无蕾培养蓝蓝、无菌吸管等用品放入无言富箱()内，打开紫外线灯灭茵30min. 7.3 水样的稀释和接种7. 3. 1 关摔紫外线灯，打开荧光灯，将待搅i水摔放入无茵章程(寒中，立即!:175% (V /V)的乙醇溶液浸泡的运用就淄棉球擦子，点燃无畜箱室内的需要精灯。7. 3. 27. 3. 7条的操作应在无菌箱(窒内的火焰区进行。7. 3. 2 选择i盘宜的稀释度，成使最后一个稀释度接种后培养皿中生伏的菌落数小于300个，在空白稀将水样瓶(6.2).t标上稀释度数。7.3.3 周刊倍稀释法满释水样，那用5mL无毒草吸管(6.3)
9、吸取5mL水辛辛法入ilJ45四L空也稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10-1。7. 3. 4 另取一支5mL无菌吸管吸取5mLI0水样移入到j第二个稀释水中，充分播匀，此时稀释度为10寸，依次类攘.至需要的稀释度为止。7.3.5 将不闵稀释度的水样分别接幸中型j光窗培养蓝(6.。中，每个稳释度盟主复接种35个腿，每应接种lmL，接种时左手掌托住楼养血，大拇指积食指经轻将培养提起，吸管与培养应1美成45。角相接。移Jf吸管时吸管不宜再碰到培养皿。接种时间不宜超过40.革接种一个稀释度更换1支元商吸管。7. J 6 另取组培养皿不接水样，作为空白。同时操作。7. 3. 7 将灭过酶的培养基(6.1
10、)冷却至45:1:1 C .按(7.3.5)掀开培养皿盏，将培养基灌入培养皿内，每;08 GB/T 14643.2 93 盟应灌15-20mL灌IDlB才不要使培养基直接灌在水祥上，满血后要将融化的培养基和缸中水祥彻底混合，小心勿使混合液溅到培养脏的边缘，测定一个水祥从接种到灌皿不得超过20min。7.4 培养待培养览中培养基(7.3. 7)liiIit后，销毁平盛，在生化培养籍中29士1C培养72h.8 计数与报告8. 1 培养之后，取出培养皿，若空白培养皿出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定光放。8.2 选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均离落数，并修约成二
11、位有效数字觅表伊H)。8.3 若有二个稀释度，其生长菌落数均在30-300之间，则视二者之比镀来决定，若其比值小于2，则报告其中较小的数字(见表例2及例3)。8.4 者所有稀释度的平均商落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养肌计数(见表例的。8.5 者所有草草释度的平均穰落数均小子30，赂应选择草草草季度最低的培养IDlit数见表恢15) 0 8.6 者所有稀释度均无蔼落生li:, Ij1tl以小于1乘以最低草草释倍数剪报告之觅表树苗。8. 7 者所有稀释度的平均商落数均不在30-300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300的培养IDl计数(见表例7)。8
12、. 8 以个IrnL表示循环冷却水中土壤菌群的总数含量(x)按下式计算sx=号式中:x，按(8.2)方法汁数得出的培养IDl中t支出的平均菌落数，个，F一-t数组的样品稀释度数。f9iJ表例稀释度及菌落数两稀释度菌粘泥真窗总数次1 0 . 1 10-2 10- 落毅之比(个/mLll 164 20 16400 2 295 生1. 6 37750 3 271 60 2. 2 27100 4 6500 3475 313 31 300 b 27 11 5 270 6 。o 。IXIO 7 。306 12 30600 9 糟密度报告方式(个/mLJ1.6XI0 3.6XI0 2.7Xl0 3.1XI0 2.7XI0 10 3.1XIO 9. 1 I驾于微生物能以单独个体，双双成对、链状、成簇或-Bj昆等形式存在，离豆没有单独一种培养基能满足一个水样中所有组爵的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能重要低于其正常榕在的活细胞的数目。9.2 标准平皿t数的正确度随着平行样皿的增加而增加，25使用5个平行皿，每皿加1mL样品时测定络果的意信度为民兴。509 GB/T 14643.2-93 附加说明z本标准自巾华人民共和国化学工业部提出。本标准由化学工业部天津化工研究院归口。本标准自海京大学和南京市化学工业研究设计院负责起寨。本标准主主要起草人曾在召臻、解正宽、王勇、张林群。:-; J 0
