1、中华人民共和国国家标准工业循环冷却水中土平皿计数法的测定Industrial circulating cooJing water-Examination of soil fangiSrandard of plate count 1 主题内容与适用范围本标准规定了工业循环冷却水中土壤真菌的测定方法。GB/T 14643. 4 93 本标准适用于工业循环冷却水中土壤真菌的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中土壤真菌的测定。2 51用标准GB 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要本标准采用土壤真菌培养基，用平皿计数技术，在29士n:
2、培养72h，测定工业循环冷却水中土壤真菌的总数。4 试剂和材料本实验方法中除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB6682中三级水规格的水。4. 1 马铃薯:市售新鲜(无芽)，去皮后切成约20mmX20mmX20mm小块e4.2 葡萄糖(HG31094); 4.3 琼脂:生物试剂;4.4 氯化纳(GB1266); 4.5 乳酸;4.6 乙醇(GB678)，75%(V/V)溶液54. 7 硫代硫酸纳(GB637); 4. 8 牛皮纸;4.9 医用脱脂棉;4. 10 跃用脱脂纱布。5 仪器和设备5. 1 元菌箱(室)或超净工作台;5.2 蒸汽压力灭菌器s5. 3 生化培养箱5国家技术监督局1993
3、 -08-06批准;l16 1994-07-01实施GB!T 14643.4-93 5.4 鼓风也热子燥箱z温度可控制在(60-280)士2(;，5.5 铝锅:200mm , 5.6 搪瓷最杯:1 OOOrnL , 5. 7蘑口三角瓶:1000mL，5.8 培养DlI.: ;90mm; 5.9 磨口试剂瓶:1000mL，5.10 刻度吸管:1mL , 5.11 刻度吸管:5mL，5.12 三角辈革:500mL.6 试验前的准备6. 1 培养摹的制备称取约20饨的马铃薯子告墨镜中，加水约1OmL在电炉上奴热溶解后，盖在热思路层愿用贱黯纱布过滤萝j搪瓷辈辈杯中，收集到约900mL滤液，滤液搅匀待用
4、。子上述滤液中加入20.08琼E旨和20.0g葡萄糖，并放在电炉上加热，不断地搅拌，待琼崩究金溶化后趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪黯量杯中，用热水补充至1OOOmL.并用乳酸调节pH至4.0士O.1 .并分装在500mL三角瓶中，每瓶分袋虽不越过其总量的2/3，察上擦塞，再用牛皮纸把握口包好，用蒸汽压力灭蕾棒子121士1(;灭离15min.6.2 元葛串串释水的秘备6.2.1 生理盐水的配1liJ，称取8.5g氯化销溶解在1000mL水中，混匀.6.2.2 将生理盐水(6.2.1)分装在1000mL磨口三角瓶中，每瓶45mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片，黎紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮
5、纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于121士1(;灭茵15自由。6.3 到i度吸管的灭菌6. 3. 1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花1重要适宜，长度大约10-15mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉.6.3.2 每3械度吸管用一条约40-5Omm宽的牛皮纸条，以45左右角螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端F曾多余的纸条折叠打绪，不使散开，标上量度，辛苦于文摇成一束，摄电热子燥箱中于160士2(;灭菌2h，6.4 培养皿的灭菌将洗净并烘干后的培养DlI.1 ()个左右登在一起，用牛皮纸卷成一筒，最惠热干燥箱中于160士2(;灭蔼浊。6.5 采祥瓶的灭菌将洗净并烘干后的
6、1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中于160土2C灭菌2h，6.6 毒草代硫酸镑的灭蕾将硫代硫酸销放入无营商箱室内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30mino7 测定步骤7.1 水祥的采集7. ,. 1 用无黯采祥瓶采集被测样品，在采样过程中要保护瓶口和瓶颈，防止这些部分受杂德污染，旅内要留下足够的空间，以备测定前摇动。7. 1. 2 若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下子无菌采样瓶(6.的中加入灭过酶的硫代硫酸锵(6.7).如入量为每升水样约O.lg.517 GB/T 14643.4-93 7. 1. 3 水祥采集后应立即进行测定，如果2h内不能
7、进行测定，应把水祥放在冰箱中，于4-10.C保存，保存时间不宜越过24ho经冷冻保存后的水中非需测定时，从冰箱中取出，于301;:左右活化4-5h再进行测定。7.2 无蔑籍交灭蕾将实验所用的无菌稀幸事水、无蕾培养茸茸、无菌吸管等用品放入无首箱交内，打开紫外线灯灭蔼30mn 0 7.3 水样的稀释和接种7. 3. 1 美掉紫外灯，打开荧光灯，将待澳i水样放入无茵箱(在)中，立即用75%(V!V)的乙董事溶液浸泡的运用蜕黯擦擦子，点燃无言富籁室内的滋辈辈上了。7.3.2-7.3.7条的操作E挂在无菌箱(室)内的火焰区进行。7.3.2 选择适宜的稀释度，成使最后一个稀释度接种后培养皿中生长的菌落数小
8、于300个，在空白稀稀水样瓶(6.2)上标上稀释倍数。7.3.3 用10然稀释法稀释水样.llP黯5mL7;离吸管(6.3)吸取5mL水样泼入到45阻L空白稀辈革水中充分摇匀，此时稀释度为10叫。7. 3. 4 另取文5mL无菌哦管吸取5mL10叶水样注入j第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为102，依次类推，直至需要的稀释度为止。7.3.5 将不向草草释度的水辛辛分罢IJ接矜萝j元首富培养应付.的中，每个稀释度囊复接种3-5个i里，每lIll.接种1白L.接手中Ht左手掌托位主音养盟，大拇指和食指轻轻将培养lIll.提起，吸管与培养盗凑成45。角相援。移开吸管时，吸管不宜再碰到培养皿。接种
9、时间不宜超过48，每接种一个稀精度更换一支无橱吸管。7.3.6 另取一级培养皿不接水样，作为空白。同时操作。7.3.7 将灭过酶的培养基(6.1)冷却至45:t:1C.按7.3.5掀开培养血棠，将培养基灌入培养血肉，每组应灌15-20mL，灌lIll.a才不重要使培养基直接灌在水祥上，草草E皇后要将磁化的培养基和辈革中水祥彻底混合，小心勿使混合液溅J培养血的边缘，测定一个水样从接种3itl灌血不得超过20min，7.4 培养待培养皿中培养基(7.3.7)困化后，但l最3jL皿，在生化培养箱中29土11;:熔养72h。B 计数与报忿8. 1 培养之后，取出培养血，若空白培养lIll.中出现菌落，
10、表明测定过程中有将染，本次测定无效。8. 2 选捧平均菌落数在30-300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均盲目落数，并修约成立，位有效数字(见表领11)。8.3 若有两个辛苦释度，其生长离落数均在30-300之间，我t视二者之比古董来决定，若其比您小子2.应报告其平均数.若大于2则报岱其中较小的数字(见表例2反倒3)。8.4 若所有稀释度的平均菌落数均小子30.则应选择稀释度最低的培养lIll.计数(见表例5)，8. 5 若所有草草释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之见表例6)。8.6 若所有稀释度的手均毯落数均不在30-犯台之间，其中一部分大子3苦苦另一部分小子3古时.OO
11、J选择最接近30或300的培养现计数(见表例7)。8. 7 以个/mL表示循环冷却水中土壤真菌的总数含量(X)，按式(1)计算sX号式中，X，一一按(8.2)方法计数得出的培养皿上长出的平均菌落数，个$F一一计数短的样品稀辛辛倍数。518 ,.( 1 ) GB/T 14643.4 93 例表稀释度及菌烙数两稀释度菌粘泥真菌且数报告方式例次落数之比个/mL10 10 10-3 斗、/mL1 164 2号164己。1. 6XI0 2 295 46 1. 6 37750 3.6XI0 3 271 60 2町227 100 2.7XI0 4 6500 3475 313 31 300 3.1 X 10军
12、5 27 11 5 270 2.7X10 6 。IX10 10 7 12 30600 3.1X1铲9精密度9. 1 出子微生物能以单独个体、双双成卫队链3坟、或簇或一愿昆等形式存在，怒旦没有单独一称培养基能满足一个71样中所有细菌的生理要求，所以，由此法所得的菌落数可能突低于其正常存在的活细胞的数目。9.2 标准J平肌i十数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用5个平行皿，每皿加lmL样品时测定结果的置信度为95%0附加说自)j，本标准出中华人民共和弱化学工业部祭出。本标准由化学工业部天津化工研究院归口。本标准dl南京大学和南京市化学工业研究设计院负责烟草。本标准主要起草人曾ag琪、解正宽、玉勇、张林群。;)19
