1、ICS 11220B 41 囝雪中华人民共和国国家标准GBT 1 79991 O一2008代替GBT 179999 1999SPF鸡 微生物学监测第1 0部分：SPF鸡 间接免疫荧光试验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 1 0：Indirect immunofluorescent assay for SPF chicken200812-31发布 2009050 1实施丰瞀徽鬻瓣警糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“”。刖 昌GBT 17999102008GBT 17999(SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SPF鸡微生物学监
2、测总则；第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；第7部分：SPF鸡胚敏感试验；一一第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分为GBT 1 7999的第10部分。本部分代替GBT 179999-1999(SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分与GBT 1799991 999相比主要变化如下：增加了规范性附录A“试剂的配制”和资料性附录B细胞计数方法”；详细界定了试验成立条件和待检样品的判定标准。本部
3、分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜骞、司昌德、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 1799991 999GBT 1799910一2008SPF鸡微生物学监测第10部分：SPF鸡 间接免疫荧光试验1范围GBT 17999的本部分规定了间接免疫荧光试验的技术要求等。本部分适用于对SPF鸡进行鸡传染性贫
4、血病毒(Chicken Infectious Anaemia Virus，CIAV)抗体的检测。2原理间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的抗抗体结合，形成抗原一抗体抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用下，激发出可见的荧光，因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用已知抗原及荧光色素标记的抗抗体检测相应的抗体。3试剂和器材31试剂311 CIAV病毒DELROSE株。312阴性、阳性血清。313被检血清。314磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录A)。315异硫氰荧光素(FITC)标记抗鸡IgG(按说明稀释使用)。31
5、6缓冲甘油或封片剂(见附录A)。317丙酮。32器材321抗原片。322湿盒。323 37培养箱。324荧光显微镜。4操作程序41感染细胞的制备用含15新生牛血清的DMEM培养基在39和5二氧化碳环境中培养MDC&MSBl细胞。细胞长至每毫升5106个时(细胞计数参见附录B)，接种CIAV，并换成含5新生牛血清的DMEM培养基，继续培养36 h48 h。42抗原片的制备421 细胞病变(细胞体积增大2倍3倍)约达5075时，收集细胞培养物，以1 500 rmin离心10 min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物3次，并细胞计数，用PBS重悬细胞浓度。422取10 pL细胞悬液(约含细胞105个
6、)，滴加于抗原片各L中，同时制备正常细胞对照片。423吹干滴好的抗原片，用4预冷的丙酮固定10 rain，保存于-20，一周内使用。GBT 1799910200843间接荧光抗体染色431取出抗原片室温放置10 rain待用。432用PBS将被检血清、阴性血清、阳性血清分别稀释成1：100、1：500两个稀释度，分别取10 pL滴加于抗原片各孔中。433将加样抗原片置于湿盒内，37孵育30 min。434用PBS浸洗3次，每次10min。435取20 pL FITC标记抗鸡IgG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育、洗涤同前。436用缓冲甘油封片，置于荧光显微镜下观察。5结果判定51试验成立条
7、件CIAV感染细胞制备的抗原片中，加入阳性血清，细胞核内可见清晰的黄绿色荧光颗粒；加入阴性血清，细胞核内无荧光颗粒。正常细胞制备的抗原片中，加入阳性血清，细胞核内无荧光颗粒。在以上条件成立的基础上，进行待检血清判定。52待检血清的判定CIAV感染细胞制备的抗原片中，加入待检血清，细胞核内可见清晰的荧光颗粒，则待检血清判为阳性。附录A(规范性附录)试剂的配制GBT 1 79991 02008A1缓冲甘油9份分析纯无荧光的甘油加1份O2 molL碳酸盐缓冲液(pH92)配制而成。A2 02 molL碳酸盐缓冲液(pH92)o17 g碳酸钠(Na。CO。)和1545 g碳酸氢钠(NaHCO。)溶于1
8、00 mL去离子水中，4保存3个月。A3 PBS(001 molL PBS，pH74)8 g氯化钠(NaCl)、02 g氯化钾(Kcl)、29 g磷酸氢二钠(NazHPOa12HzO)、02 g磷酸二氢钾(KH：PC)。)，重蒸水加至1 000 mL；保存于4备用。A4 DMEM(高糖)培养液10 g DMEM粉，37 g碳酸氢钠(NaHCO。)溶解于950 mI，去离子水中，边加边搅拌。用1 molL的氢氧化钠或盐酸将培养液pH值调至697o，加去离子水定容至1 000 mL，尽快用孔径022 pm的微孔滤膜过滤除菌，4冰箱保存备用。GBT 17999102008附录B(资料性附录)细胞计数方法B1对细胞进行系列稀释，滴加到细胞计数板上，初步观察，若细胞密集，进一步稀释后，重新滴加到干净的细胞计数板上计数。B2细胞计数板在5物镜下可见9个大方格，于10物镜下计数位于4个角的大方格内的细胞数量(若细胞位于大方格边线，仅计数位于上边线和左边线的细胞)；并依据式(B1)计算细胞浓度。起始细胞浓度(个mL)=尘全盘查整4立鱼堙幽稀释倍数104 (B1)示例：若4个大方格内的细胞总数为25个，细胞稀释度为1：103，则起始细胞浓度一孕103104=625X107(JmL)参考文献Eli NYT 681 2003鸡传染性贫血诊断技术GBT 1799910一20085
