1、ICS 11220B 41 雷亘中华人民共和国国家标准GBT 1 799922008代替GBT 179991 1999SPF鸡 微生物学监测第2部分：SPF鸡 红细胞凝集抑制试验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 2：Hemagglutination inhibition test for SPF chicken2008-12-31发布 2009-050 1实施丰瞀徽鬻瓣訾矬瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仅111刖 昌GBT 1 799922008GBT i7999SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SPF鸡微生物学监测总则；
2、第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；一一第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；一一第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；一第7部分：SPF鸡胚敏感试验；第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第lo部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分为GBT I 7999的第2部分。本部分修订参照了GBT 18936 2003高致病性禽流感诊断技术、SNT 1109 2002新城疫微量红细胞凝集抑制 试验操作规程、SNT 11822 2004禽流感微量红细胞凝集抑制试验、NYT 551 2002产蛋下降综合征诊断技术
3、、OIE陆生动物(哺乳动物、禽鸟和蜜蜂)诊断试验和疫苗手册(第五版)中的有关规定。本部分代替GBT 179991 1999SPF鸡红细胞凝集抑制试验。本部分与GBT i79991 1 999相比主要变化如下：一一增加了规范性附录A“试剂的配制”和资料性附录B“1鸡血红细胞悬液的制备”；增加了对v形孔微量血凝板进行试验的结果判定；对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽腺病毒群(EDS)鸡毒支原体和滑液囊支原血凝抑制抗体的判定标准进行了修改。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本
4、部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜骞、司昌德、于海波、盂庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 179991 1999。GBT 1799922008SPF鸡微生物学监测第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验1范围GBT 17999的本部分规定了红细胞凝集抑制试验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血凝抑制抗体检测：禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus)，传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Vi
5、rus)，新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)，禽腺病毒群(减蛋综合征病毒)(Avian Adenovirus Group)，鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)，滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)。2原理许多病原微生物具有凝集动物红细胞的能力，这种凝集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制，因此可用已知病原微生物检测相应的血凝抑制性抗体。3试剂和器材31试剂311血凝抗原。312阴性、阳性血清。313被检血清。314鸡红细胞。315 085氯化钠(NaCI)(见附录A)。316阿氏液(见附录A)。32器材321 96孔微量血凝板
6、(u形孔或V形孔)。322微量移液器(量程为25 pL、50 pL、100 pL)或可调微量移液器(量程涵盖25 pL、50 pL、100 PL)及吸头。323水浴锅。324离心机与刻度离心管。4操作程序41 红细胞悬液的制备和抗原血凝效价测定411 1鸡红细胞悬液的制备参见附录B。412抗原血凝效价测定4121于96孔微量血凝板的第1孔第12孔加入生理盐水25 pL，共作2排。每排的第1孔加入抗原25 pL，用微量移液器，从第1孔第11孔对抗原作系列倍比稀释：即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后，吸出25 pL移至第2孔，再反复吹吸3次后，吸出25 pL移至第3孔，依此类推，直至
7、第11孔。从第11孔中吸出25 pL弃去，此孔抗原的最终稀释度为1：2“(即11 l092)。第12孔作为对照孔。1GBT 179992200841224123412460rain。4125每孔中加入25 pL生理盐水，再加入1鸡红细胞悬液25 pL。将血凝板置振荡器上500 rrain振荡1 min2 rain。在室温1825下静置20 rain 40 rain，或37静置15 min 20 rain，或4静置抗原血凝效价判定：在反应时间内，对照孔的红细胞全部沉淀时，观察判读血凝结果。对于使用u形孔微量血凝板进行的试验，可根据表1中列举的标准进行判读。表1 血凝试验结果判读标准类 别 孔底所
8、见 结 果1 红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100红细胞凝集 +2 红细胞凝集基本同类别1，但孔底有大圈 牟牟_3 红细胞于孔底形成中等大的固，四周有小凝块 +4 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 +5 红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集注：能使红细胞完全凝集(100凝集，+)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位。注意对照孔应呈现完全不凝集()，否则此次试验无效。对于使用v形孔微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜70。，观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜面向下呈线状流动。以出现全部凝集(红细胞无流动)的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，该效价为1个
9、血凝单位。若血凝效价高于11 log。时，可继续增加稀释孔数，进行血凝效价测定。血凝试验举例说明见表2。表2微量血凝试验操作、结果判定举例孔号 l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll 12滴度(109。) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1l 对照生理盐水pL 251 25 251 251 251 251 25 251 25 251 251 25倍比稀释的抗原pL 25 J 25 J 25j 25 J 25 J 25j 25 J 25 J 25 J 25 J 25广 生理盐水pL 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 251鸡红细胞pL 25 25
10、 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用温度、时间 1825，静置2040m判定举例 + + + + + +十 + + + + +弃去25uL血凝价判定为9 l092。42血清的处理和血凝抑制试验421被检血清样品准备被检血清，包括阳性、阴性血清，置于56水浴中30 min45 rain，以破坏补体及血凝抑制因子。422抗原准备进行血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位为4个血凝单位。以4个血凝单位抗原的配制为例：如果某抗原的血凝效价为9logz，配制4个血凝单位则进行1：27稀释(29z227)，取生理盐水118 mL，加入1：10稀释的抗原10 mL，混合均匀即可。42
11、3抗原血凝效价的重测定4231为了确证血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对已配制的4个血凝单位抗原进行血凝效，GBT 1799922008价的再测定，此项试验常与血凝抑制试验同时进行。4232第1孔分别加入50“L 4个血凝单位抗原。4233第2孔第4孔各加生理盐水25zL。4234将抗原分别作系列倍比稀释至第4孔，从第4孔吸25 pL弃去。4235每孔加1鸡红细胞悬液25 pL。4236将血凝板置微量振荡器上以500 rmin振荡1 min2 min。4237室温1822感作20min40min左右。4238观察结果，4、2、1血凝单位孔红细胞出现完全凝集，05血凝单位孔红细胞出现50凝集
12、。若不相符，则应重新标定抗原的血凝单位，同时进行的血凝抑制试验也需重新进行。424血凝抑制试验424I血凝板每排检测一份被检血清，设阳性血清与阴性血清对照。4242第1孔第12孔，每孔加入25 pL生理盐水。4243吸取血清25“L加入第1孔中，混匀后吸取25 pL加入第2孔中，依此类推倍比稀释到第11孔，弃去25 pL，第12孔作为空白对照孔。4244第l孔第11孔分别加入25 pL 4个血凝单位抗原。血凝板置微量振荡器上以500 rmin振荡1 min2min。4245每孔加入1鸡红细胞悬液25 pL，以500 rmin振荡1 min 2 min混匀，置室温(1822)静置20min 40
13、min或4静置60min，此时对照孔(第12孔)的红细胞已沉淀为一个圆点。4246静置完毕，对于使用U形孔微量血凝板进行的试验，根据表l中列举的标准进行判读。对于使用V形微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜70。，凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜面向下呈线状流动。呈现与红细胞对照iL(第12L)一样者为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度为该被检血清血凝抑制效价。血凝抑制试验举例说明见表3。表3微量血凝抑制试验操作、结果判定举例孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 lO ll 12滴度(1092) l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll 对照生理盐水tLL 25 1 251 251
14、 25 1 251 251 251 251 251 251 251 25倍比稀释的被检血清pL 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25j 25广 4个血凝单位抗原gL 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用温度、时间 1825，静置2040 rain1鸡红细胞pL 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25作用温度、时间 18-25，静置2040 rain判定举例 + l+l+ +J+ +被检血清血凝抑制价为1：32(25)。5结果判定弃去25uL51检查各种对照。阴性血清血凝抑制
15、滴度应l：4(22)，阳性血清血凝抑制滴度与已知滴度不应相差一个滴度以上。红细胞对照无血凝现象。52禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽腺病毒群(EDS)的血清血凝抑制效价1：16(24)判为阳性；鸡毒支原体、滑液囊支原体的血清血凝抑制效价1：64(2 6)判为阳性。GBT 1799922008A1 阿氏液(Alsever 7s)附录A(规范性附录)试剂的配制葡萄糖205 g，氯化钠(NaCI)042 g，柠檬酸钠(NasCsHtO，2H：O)08 g，柠檬酸H。0)0055 g，加蒸馏水定容至100 mL，过滤，121高压灭菌15 rain，4保存备用。A2 085生理盐水(pH
16、74)4氯化钠425 g，溶于500 mL蒸馏水，调pH至74，121高压灭菌15 rain，4保存备用。附录B(资料性附录)1鸡血红细胞悬液的制备GBT 1 799922008B1鸡血采集用注射器吸取阿氏液约1 mL，取3周龄10周龄SPF鸡(最少两只)，从胸骨尖下方约13 cm处将注射器针头刺人心脏，吸取心血约2 mL4 mL，与10 mL阿氏液轻轻混合并置于离心管中。B2鸡红细胞洗涤将离心管中的血液经1 500 rmin1 800 rmin离心8 min，弃上清液和沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再次加入阿氏液，再重复tad：过程后，加入阿氏液20 mL，重悬沉淀，轻轻混合成红细胞悬液。B3红细胞体积(压积)准确计算保存在阿氏液中的鸡红细胞悬液体积(V，)，经1 500 rraintl 800 rrain离心8 min，吸取上清液，计算其体积(v：)，计算红细胞体积V。(Vs-V-一Vz)。B4 1鸡红细胞悬液1倍体积(mI。)的红细胞，加入99倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞均匀混合。GBT 1799922008参考文献Eli GBT 18936-2003高致病性禽流感诊断技术E2 NYT 551-2002产蛋下降综合征诊断技术3SNT 1109 2002新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程E4SNT 11822 2004禽流感微量红细胞凝集抑制试验
