1、ICS 11220B 41 囝雪中华人民共和国国家标准GBT 1 799932008代替GBT 179992 1999SPF鸡 微生物学监测第3部分：SPF鸡 血清中和试验2008-12-31发布SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 3：Serum neutralization test for SPF chicken20090501实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局告寿中国国家标准化管理委员会及11前 言GBT 1799932008GBT 17999(SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SPF鸡微生物学监测总则；第2部分
2、：SPF鸡红细胞凝集抑制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；一一第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；一第7部分：SPF鸡胚敏感试验；第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；一一第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分为GBT 17999的第3部分。本部分修订参照OIE(陆生动物(哺乳动物、禽鸟和蜜蜂)诊断试验和疫苗手册(第五版)中的有关规定。本部分代替GBT 179992 1999SPF鸡血清中和试验。本部分与GBT 179992 1999相比主要变化如下：增加了规范性附录A“试剂的配制”、
3、资料性附录B“病毒接种技术”以及资料性附录C“鸡胚接种病毒后的病变特征”；一在试验内容部分，增加了病毒的稀释梯度；对不同病毒致死鸡胚的时间重新确定。本部分附录A为规范性附录，附录B、附录C为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜骞、司昌德、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 179992-，1999。SPF鸡微生物学监测第3部分：S
4、PF鸡血清中和试验GBT 17999320081范围GBT 17999的本部分规定了血清中和试验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行以下病毒中和抗体的检测：禽脑脊髓炎病毒(Avian EncephalomyelitisVirus)、传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)、传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus)、传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)。2原理中和试验系指有生物活性的病毒与相应的抗体结合后，失去原有的生物活性的中和反应。中和反应不仅有高度特异性，
5、且具有严格的量的关系。因此可用中和试验鉴定病毒，也可用于相应抗体的定量检测。3试剂和器材31试剂311 病毒：禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株(CVCC AV35)、传染性支气管炎病毒H52(CVCCAVl 513)、传染性法氏囊病病毒A80株(CVCV AV2321)、传染性喉气管炎病毒A96(CVCC AV200)。312病毒稀释液：胰蛋白胨磷酸盐肉汤(见附录A)。313青霉素链霉素(双抗)液(见附录A)。314 3碘酊溶液。315 SPF胚蛋。32器材321蛋钻(打孔器)。322 6号针头。323 7号针头。324混合器。325照蛋器。4操作程序41试验准备411血清样品处理被检血清
6、和阳性对照血清经56、30 min45 min灭活补体，保存于20条件下备用。412 SPF胚蛋准备照胚检查胚体活力，选取血管清晰、胚体规律摆动的健康胚蛋，每个检测项目需胚蛋24枚。413稀释病毒4131取灭菌试管4支9支，每管加入稀释液4 mL、青霉素链霉素液05 mL。4132第1管加入病毒液05 mL，作连续10倍稀释。各种病毒的稀释度参见表1。1GBT 1799932008表1病毒稀释病 毒 稀释度禽脑脊髓炎病毒 10一1lO 6传染性支气管炎病毒 10 110一9传染性法氏囊病病毒 io 2Io一6传染性喉气管炎病毒 10 110一642中和试验421血清准备每份被检血清需15mL。
7、422病毒稀释度选择根据具体情况决定，一般选择6个连续的病毒稀释度。检测SPF鸡血清样品时，病毒采用较高稀释度，如10一310。检测阳性对照血清样品时，病毒采用较低稀释度，如1010。检测普通鸡血清样品时，病毒稀释度常采用10。10。423病毒与血清混合感作将血清与不同稀释度的病毒等体积混合后，经37感作，感作时问见表2。表2 血清与病毒混合感作时间病 毒 感作时间rain禽脑脊髓炎病毒 60传染性支气管炎病毒 30或60传染性法氏囊病病毒 60传染性喉气管炎病毒 45424接种鸡胚4241病毒与血清混合感作后接种鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接种02 mL。4242病毒对照：将不同稀
8、释度的病毒液，分别接种鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，每枚鸡胚接01 mL。4243接种：根据病毒种类选择接种方法(见表3)。表3病毒接种胚龄与方法病毒种类 胚龄d 接种方法禽脑脊髓炎病毒 57 YS1传染性支气管炎病毒 910 CAS传染性法氏囊病病毒 10 CAM传染性喉气管炎病毒 910 CAS注：Ys卵黄囊；cAs尿囊腔；cAM绒毛尿囊膜(接种方法参见附录B)。425孵化将接种后的鸡胚放人孵化器，继续孵化。根据病毒不同，选定不同的孵化时间(见表4)。表4 接种鸡胚的孵化时间GHT 1799932008病 毒 孵化时间d禽脑脊髓炎病毒 1012传染性支气管炎病毒 8传染性法氏囊病病毒 7传
9、染性喉气管炎病毒 7426观察和记录每日照胚，记录各组鸡胚的死亡数(24 h内死亡的鸡胚忽略不计)；孵化期满，记录各组鸡胚的感染数(参照附录c中的描述进行判定)。427计算中和指数4271统计原理结果以中和指数表示，中和指数表示被检血清中有无中和抗体及中和病毒的能力。为求中和指数，应计算出病毒对照和被检血清病毒的ELD。此二者的差数即为中和指数(Reed和Muench法)，参见示例。示例：病毒对照组及血清病毒试验组死亡情况见表5和表6。表5病毒对照组死亡情况累 计病毒稀释度 死亡比例 死亡 存活死亡 存活 死亡比例 死亡百分率“10-5 44 4 0 13 0 1313 100o10 6 44
10、 4 0 9 0 99 100010 7 24 2 2 5 2 S7 71410 8 24 2 2 3 4 37 42 810 9 14 1 3 l 7 18 1251010 04 O 4 0 11 o11 O注：分母表示接种鸡胚数，分子表示因病毒感染死亡鸡胚数(表6同)。表6血清病毒组死亡情况累 计病毒稀释度 死亡比例 死亡 存活死亡 存活 死亡比例 死亡百分率10一4 44 4 0 17。 O 1717 10010 5 44 4 0 13 O 1a13 10010_6 44 4 0 9 0 99 10010 7 34 3 1 5 1 56 83310-8 24 2 2 2 3 25 401
11、0一9 o4 0 O 0 3+ os 04272中和指数计算被检血清的中和指数为病毒对照组ELD；。效价与血清病毒组ELD。效价的差值。ELD。效价为高于50死亡的病毒稀释度倒数的对数与距离比之和，其中距离比按式(1)计算。GBT 1799932008距离比 高于50的死亡百分数一50于50的死亡百分数 低于50的死亡百示例：表5中，病毒对照组ELD。效价在1010“之间，则：病毒组对照组ELDs。效价一7+砉粉-7+O75-775表6中，血清病毒组ELDs。效价在10_7-10“之间，则：血清病毒组对照组ELDs。效价一7+黼一7+o76=776被检血清的中和指数一775776=oOl5结果
12、判定被检血清的中和指数2o为阳性。4(1)附录A(规范性附录)试剂的配制A1 胰蛋白胨磷酸盐肉汤(tryptone phosphate broth)GBT 1799932008胰蛋白胨 200 g葡萄糖 2O g氯化钠(Nacl) 50 g磷酸氢二钠(NazHPOt) 25 gpH 73土02加1 L双蒸水，完全溶解后分装，121灭菌15min，4保存备用，可放置6个月。A2青霉素链霉素(双抗)液青霉素 100 000U链霉素01 g加双蒸水至10mL，经无菌022 pm滤器过滤除菌后，一20保存备用，可放置12个月。GBT 1799932008附录B(资料性附录)病毒接种技术B1 卵黄囊(Y
13、s)接种选5日龄7日龄鸡胚经照蛋检查后，画出气室和胎位，对应气室中央的蛋壳先用25碘酒消毒，再用75酒精脱碘。用打孔器打一小孔，勿损伤壳膜。接种时针头迅速稳定地通过小孔，沿胚的纵轴深入约3 gin，此时注射器轻轻往回抽一下，如针头在卵黄囊中，可见卵黄被抽出，此时就可将注射物注入，用融化的石蜡封闭壳孔，置37培养。B2尿囊腔(CAS)接种选9日龄11日龄鸡胚，照检后画出气室边界，在气室交界边缘以上约1 mm处并避开血管作一标记，此即为注射点。在点周围先用25碘酒消毒，再用75酒精脱碘。用打孔器在注射点处打-d,孔，勿损伤壳膜。用注射器注入样品02 mL，然后用融化的石蜡封口，置37培养。B3绒毛
14、尿囊膜(cAM)接种选10日龄鸡胚，在胚胎附近略近气室处，选择血管较少的部位，用记号笔在卵壳上标记出一个直径约3 YIIITI4mYEI的圈，用25碘酒消毒，再用75酒精脱碘，小心用刀尖将圈内的卵壳撬起，造成卵窗，但不可损伤壳膜。在气室端也钻一个小孔。随后用针尖轻轻挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。滴加1滴灭菌生理盐水于刺破处。用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴加于壳膜上的生理盐水迅速渗入。用14号针头器滴人2滴3滴接种物于绒毛尿囊膜上。最后用透明胶纸封住卵窗，周围涂以融化的石蜡密封之。气室中央的小孔可用石蜡密封
15、住。鸡胚在接种后，横卧于孵卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。置37培养。附录c(资料性附录)鸡胚病变特征GBT 1799932008c1 禽脑脊髓炎病毒所致的特异病变早期为胸腹部肌肉皮下水肿，当接种后10 d12 d，解剖活胚时，见腿肌萎缩、足趾卷曲。如出现此类特征，判为感染。c2传染性支气管炎病毒所致的特异病变鸡胚卷曲、矮小，脚变形压在头上，羊膜增厚、卵黄囊收缩、易破裂。如出现此类特征，判为感染。C3传染性喉气管炎病毒所致的特异病变感染传染性喉气管炎病毒的鸡胚，可在绒毛尿囊膜上形成痘斑。如出现痘斑，判为感染。C4传染性法氏囊病毒所致的特异病变鸡胚充血，在羽毛囊、趾关节和大脑有血斑性出血，肝脏多可见坏死，可见灰质肝体似熟肉样。如出现此类特征，判为感染。GBT 1799932008参考文献1GBT 19167-2003传染性囊病诊断技术E2NYT 556 2002鸡传染性喉气管炎诊断技术
