1、ICS 11220B 41 囝雪中华人民共和国国家标准GBT 1 799962008代替GBT 179995-1999SPF鸡 微生物学监测第6部分：SPF鸡 酶联免疫吸附试验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 6：Enzyme-linked immunosorbent assay for SPF chicken2008-12-31发布 2009-05-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局辔士中国国家标准化管理委员会及仲前 言GBT 1799962008GBT 17999SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SPF鸡微
2、生物学监测总则；一一第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；一第7部分：SPF鸡胚敏感试验；第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分为GBT 17999的第6部分。本部分修订参照了OBT 18936 2003高致病性禽流感诊断技术、GBT 191 67 2003传染性囊病诊断技术、NYT 538-2002鸡传染性鼻炎诊断技术、OIE陆生动物(哺乳动物、禽鸟和蜜蜂)诊断试验和疫苗手册(第五版
3、)中的有关规定。本部分代替GBT 179995 1999SPF鸡酶联免疫吸附试验。本部分与GBT 1799951999相比主要变化如下：增加了间接酶联免疫吸附试验；增加了附录A“试剂的配制”。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、姜骞、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、刘家森、司昌德、郭东春、于海波、盂庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 179995 1999。1范围S
4、PF鸡微生物学监测第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验GBT 1799962008GBT 17999的本部分规定了酶联免疫吸附试验的技术要求。本部分间接酶联免疫吸附试验适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测届0鸡嗜血杆菌(Haemophilus)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、禽流感病毒(Avian Influeza Virus)、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)、传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)、传染性法氏囊病病毒(Infe
5、ctious Bursal Disease Virus)、网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus)、鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anaemia Virus)、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)(Avian Reovirus)、禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus)、传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus)、禽腺病毒群(EDS)(Avian Adenovirus Group)、淋巴细胞白血病病毒(Lymphoid Leukosis Virus)。本部分
6、双抗体夹心酶联免疫吸附试验适用于对SPF鸡进行淋巴细胞白血病病毒P27抗原检测。2原理间接酶联免疫吸附试验采用已知微生物抗原检测未知抗体，双抗体夹心酶联免疫吸附试验采用已知抗体检测未知抗原。3间接酶联免疫吸附试验31试剂311包被抗原，阴性、阳性对照血清，羊抗鸡LgG酶标抗体，按说明书保存和使用。312包被液、稀释液、底物液、终止液配制方法见附录A。32器材酶标板，移液器，37恒温培养箱，酶标仪。33操作程序331抗原包被：将禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、副鸡嗜血杆菌、禽腺病毒群(EDS)、鸡毒支原体、滑液囊支原体、禽脑脊髓炎病毒、淋巴细胞
7、白血病病毒、网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)、鸡传染性贫血病毒抗原用包被液稀释至工作浓度，加入酶标板各孔中，每孔100 pL，置4冰箱过夜。332洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液加满各孔，放置5 min，然后甩净，如此重复3次。333加被检血清：用稀释液将被检血清以I：100稀释，每孔加入i00 pL，每次操作均设置阴性对照iL两个，阳性对照孔、空白对照孔各一个，分别加入同样稀释的阴性血清、阳性血清和稀释液各100 p-L，加不同的血清样品时应换吸头，37温箱中作用30 min。334洗涤：同332。335加羊抗鸡IgG酶标抗体：用稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加入100
8、儿，37温箱中作用30min。336洗涤：同332。337显色：加入底物液100 pL，室温避光反应5 min左右(至阴性对照孔开始产生颜色时)。GBT 1799962008338终止及读数：每孔加50 pL终止液终止显色，然后用酶标仪读取每孔在490 nm处的吸光度(OD)值。34结果判定与表示方法将样品的OD值代入式(1)计算。S 7N式中：s被检血清样品OD值；N阴性对照平均OD值。垫焦鱼道登旦Q里堡阴性对照平均OD值若sN2则结果判为阳性，记为“+”，否则判为阴性，记为“一”。4双抗体夹心酶联免疫吸附试验41试剂411包被抗体(兔抗P27 IgG)、阳性抗原(P27)、阴性抗原、被检血
9、清、被检蛋清、HRP一兔抗P27、羊抗鸡IgG酶标抗体按说明书保存和使用。412包被液、稀释液、底物液、终止液配制方法见附录A。42器材见32。43操作程序431抗体包被：用包被液将兔抗P27 IgG作适当稀释，每孔100 pL，4过夜。432洗涤：甩去包被液，每孔加满洗涤液(约300zL)，静置3 rain，甩干，如此重复3次。433加样：每孔加100 pL被检蛋清，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，37作用60 rain甩去样品，洗涤同432。434每孔加HRP一兔抗P27液(工作浓度)100zL，37作用45 min60 min，甩去HRP一兔抗P27液，洗涤同432。435加底物溶液
10、：每孔加100 pL新配制的底物溶液，避光作用15 min。436终止及读数：每孔加50“L终止液终止显色，然后用酶标仪读取每孔在490 nm处的吸光度(oD)值。5结果判定51当阳性对照OD值与阴性对照OD值之差大于或等于03时，试验结果可靠。52按式(2)计算被检样品的SP比值。 s，P一蘸黯咝OD器芒凝蒜鼹OD1一阳性对照 值均数一阴性对照 值均数 、一式中：s样品OD值；P阳性对照OD值。53判定：sP02，判为阳性；SPO2，判为阴性。A1包被液附录A(规范性附录)试剂的配制碳酸盐缓冲液(005 molL、pH96，CBS)碳酸钠碳酸氢钠用双蒸水溶解至1 000mL，于4保存，不超过
11、1个月。A2稀释液磷酸盐缓冲液(o01 molL、pH74，PBS)氯化钠磷酸二氢钠磷酸氢二钠(Naz HPOt氯化钾加蒸馏水至A3洗涤液含005Tweem20的o01 molL、pH74的PBSTween一20加001 molL、pH74的PBS至A4底物溶液pH50，磷酸盐柠檬酸缓冲液OPDHzOz磷酸氢二钠溶液(NazHPOt12H20)柠檬酸蒸馏水159 g293 g8 g02 g29 g0 2 g1 000 mL50mI，1 000mL184 g051 g100mLGBT 17999620081064 Pa、30 min灭菌，4保存备用。使用时每100 mL中加入40 mg邻NZIN(OPD)，溶解后加30HzOz 015 mL，混匀后使用。本试剂现用现配。A5终止液2 molL硫酸：硫酸(9598)蒸馏水111 mL889 mLGBT 1799962008参考文献1GBT 18936 2003高致病性禽流感诊断技术2GBT 19167 2003传染性囊病诊断技术3NYT 538 2002鸡传染性鼻炎诊断技术
