1、ICS 11220B 41 囝目中华人民共和国国家标准GBT 1799982008代替GBT 179997 1999SPF鸡 微生物学监测第8部分：SPF鸡 鸡白痢沙门氏茵检验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 8：Examination of Salmonella pullorum for SPF chicken2008-12-31发布 2009-05-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借奔中国国家标准化管理委员会厘111刖 罱GBT 1799982008GBT 17999SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SP
2、F鸡微生物学监测总则；第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；一第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；一第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；-第7部分：SPF鸡胚敏感试验；第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第10部分：SPF鸡问接免疫荧光试验。本部分为GBT 17999的第8部分。本部分修订参照了NYT 556 2002(鸡传染性喉气管炎诊断技术和OIE(陆生动物(哺乳动物、禽鸟和蜜蜂)诊断试验和疫苗手册(第五版)中的有关规定。本部分代替GBT 1799971999(SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验。本部
3、分与GBT 1 79997一-I 999相比主要变化如下：增加了活禽泄殖腔拭子检测样晶；增加了沙门氏菌菌体抗原血清学检测方法；增加了附录A“革兰氏染色方法及生化试验结果判定”；一对试验操作程序进行了修订，将细菌镜检程序提前；在范围中进一步明确了本部分使用的情况；删除了引用标准；一一修订了试验操作程序。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、姜骞、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、刘家森、
4、司昌德、郭东春、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 179997 1999。GBT 1799982008SPF鸡微生物学监测第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验1范围GBT 17999的本部分规定了鸡白痢沙门氏菌检验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行鸡白痢沙门氏菌的分离和鉴定。用血清平板凝集试验进行鸡白痢沙门氏菌的抗体检测，结果难以判断时，可采用本部分进行复检。2原理取待检样品(肠内容物、有关脏器匀浆、活禽泄殖腔拭子)接种于增菌培养基中进行增菌，然后将培养物转移到选择、鉴别培养基上培养，挑选可疑菌落接种于营养琼脂培养基上，取培养物进行生化试验与血清学试验，以确定鸡
5、白痢沙门氏菌。3试剂和器材31材料311培养基营养肉汤培养基、DHL琼脂、ss琼脂、亚硫酸铋琼脂(Bs)、三糖铁培养基(TSI)、营养琼脂、半固体琼脂。312生化反应试剂糖发酵培养基、蛋白胨水、硝酸盐培养基、氧化酶试剂、氨基酸脱羧酶试验培养基、尿素培养基(结果判定见附录A)。313沙门氏茵诊断血清AF多价O血清、09因子血清、012因子血清、Ha因子血清、Hd因子血清、H gm因子血清和HgP因子血清。32器材37恒温培养箱。4操作步骤41采样无菌采取卵巢、肝、脾以及小肠和盲肠，活禽泄殖腔拭子。42分离培养将采集样品放人灭菌乳钵或均浆器中研磨成匀浆，加入少量营养肉汤稀释。取培养物或活禽泄殖腔拭
6、子分别在ss或BS和DHL琼脂平板培养基上划线接种，置(36土1)培养24 h48 h。在DHL培养基上若出现黄褐色透明小菌落；或在ss琼脂平板上出现无色半透明圆形小菌落；或在BS琼脂平板上出现黑色或黑绿色小菌落，则为可疑菌落。如果经24 h48 h培养后未发现可疑菌落，再取增菌培养物重复划线分离培养1次。43病原鉴定431镜检取可疑菌落，涂片作革兰氏染色，具体操作见附录A。镜检可见革兰氏阴性杆菌，大小为1GBT 1799982008(03 pm05 pm)(1 pm25 pm)，无芽胞，多单个散在。432生化鉴定及运动性检查4321生化鉴定接种TSI，斜面划线，底部穿刺，置(36士1)培养2
7、4 h。其生化反应为斜面呈红色，底层变黄，有或无气体，不产生硫化氢(H：s)。如果符合则进行其他项目的检测及血清学鉴定，不符合则判为阴性。4322运动性试验将可疑菌落穿刺接种半固体培养基，(36土1)培养24 h后，观察结果。鸡白痢沙门氏菌无运动性。433生化项目发酵葡萄糖产酸或产气，不发酵乳糖和蔗糖。触酶、赖氨酸脱羧酶、硝酸盐还原试验阳性。氧化酶、尿素酶、吲哚试验、卫矛醇、麦芽糖阴性。鸟氨酸脱羧作用阳性。44沙门氏菌AF群多价。血清玻片凝集试验取可疑培养物接种三糖铁琼脂斜面，37培养18 h24 h，先用AF多价O血清与培养物作平板凝集反应，若呈阳性，再分别用09、012、Ha、Hd、H g
8、m和HgP单价因子血清作平板凝集反应，如果培养物与09、012因子血清呈阳性反应，而与Ha、Hd、Hgm和HgP因子血清呈阴性反应时，则鉴定为鸡白痢沙门氏菌。5结果判定符合上述各项实验结果，为鸡白痢沙门氏菌阳性，否则结果为阴性。生化试验和血清学试验不一致时，以血清学试验为主。2附录A(规范性附录)革兰氏染色方法及生化试验结果判定GBT 1799982008A1革兰氏染色法A11涂片，在火焰上固定。A12滴加结晶紫染色液，染色1 min，流水冲洗，甩干。A13滴加碘液，媒染1 rain，流水冲洗，甩干。A14滴加95乙醇脱色约15 s30 S，流水冲洗，甩干。A15滴加沙黄复红染液，染色10 s
9、20 s，流水冲洗，甩干、风干或滤纸吸干后镜检。A16结果：使用油镜放大1 000倍观察，革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A2三糖铁琼脂培养基(TSI)结果观察斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖、蔗糖和乳糖；高层破碎者为产气；高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖；高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。A3靛基质试剂结果观察培养物中加入柯凡克试剂者，在两种溶液交界处呈红色为阳性；加人欧一波试剂者，在两种溶液交界处呈玫瑰红为阳性。对弱阳性者可先在培养物中加人少量二甲苯，充分混匀后再加入靛基质试剂。A4甲基红试验结果观察向培养物中加入甲基红试剂一滴，立即变为鲜红色为阳性，黄色为阴
10、性。A5 V-P试验结果观察向培养物中加入6a一萘酚一乙醇溶液05 mL，40氢氧化钾溶液02 mL，数分钟内出现红色者为阳性，不变色为阴性。A6硝酸盐培养基结果观察培养物中先加入甲液3滴5滴，再加入乙液3滴5滴，出现红色者为阳性。A7氧化酶试验结果观察取滤纸条粘取菌落，加氧化酶试剂一滴，30 s内呈现红色至紫红色为阳性，于2 min内不变色为阴性；对弱阳性者应同时用绿脓杆菌做阳性对照，用大肠杆菌做阴性对照。注：不能用接种针挑取菌落，只能用玻棒或竹签。A8氨基酸脱羧酶试验结果观察从琼脂斜面上挑取培养基接种，于(36士1)培养18 h24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色，阴性者无碱性，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管为黄色。A9尿素试验结果观察培养基由黄变红者为阳性。
