1、ICS”220B 41 鳕雪中华人民共和国国家标准GBT 1 8089-2008代替GBT 18089-2000蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术Isolation，identification and serum neutralization antibodytest in Bluetongue virus2008-12-31发布 2009050 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借寿中国国家标准化管理委员会厘111刖 吾GBT 1 8089-2008本标准代替GBT 18089 2000蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法。本标准与GBT 18089 2000相比主
2、要变化如下：对标准名称进行了修改；删除了蓝舌病病毒鉴定中的病毒中和试验部分；增加了病毒鉴定中RTPCR方法的鉴定。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：周晓黎、杨建明、艾军、花群义、杨晓花、张其艳、严树发、董俊、叶玲玲、徐维加。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 18089一-2000。1 范围蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术GBT 1 8089-2008本标准规定了蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测
3、的技术。本标准适用于蓝舌病病毒的分离、鉴定及动物感染蓝舌病病毒后血清中和抗体的检测。2符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本标准。BHKz，幼仓鼠肾细胞株；BLP乳糖蛋白胨缓冲肉汤；BT蓝舌病；bp一一碱基对；cPE致细胞病变作用；C636一一蚊子细胞株；DEPC焦碳酸二乙酯；SPF无特定病原体；TCIDs。半数组织培养感染量；Vero非洲绿猴肾细胞株。3蓝舌病病毒分离31材料10日龄11日龄SPF鸡胚。32设备与器材鸡胚开孔器、照蛋灯或照蛋箱、乳钵或组织捣碎器、倒置显微镜。33试验程序331样品肝素抗凝血(每5 mL血液用10IU肝素)、脏器(脾、肝、肾、淋巴结)、精液、库蠓。用于病毒分离的样
4、品应置冷藏容器中保存，在24 h内送到实验室，并立即进行处理。332血液样品制备取肝素抗凝血5 mL，用磷酸盐缓冲液(PBS，配方见附录A)洗涤血样3次4次，每次2 000 rrain离心10 min，弃上清液后加入倍量BLP(配方见附录A)，置冰浴中用超声波处理(40”A、1 rain)。经处理的样品当天使用，使用前置4保存，剩余样品置一70保存备用。333组织样品制备无菌采集动物脾、淋巴结、肝、肾各5 g，剪碎后加入BLPl0 mL(含青霉素2 000 IUmL、链霉素2 000 ugmL)，置乳钵中研磨，4冰箱中浸提4 h，取上清液5 mL用超声波裂解处理(100 pA、1n2 min)
5、或冻融三次，3 000 rrain离心20 min，取上清液使用，使用前置4保存，剩余样品置一70保存备用。334精液样品制备取精液样品05 mL，用BLP作1：5稀释后，3 000 rrain离心20 min，弃上清液，再用BLP作1GBT 1 8089-2008l：5稀释，充分混匀，置冰浴中用超声波处理(100 pA、1 rain 2 rain)或冻融三次，3 000 rrain离心20 rain，取上清液使用，使用前置4保存，剩余样品置-70保存备用。335库蠓样品制备取200个300个库蠓盛于小试管中，加入含青霉素2 000 IUmL、链霉素2 000 pgmL的BLP 3 mL-5
6、rnL，置冰浴中研磨虫体，3 000 rmin离心20 min，取上清液使用，使用前置4保存，剩余样品置70保存备用。336鸡胚静脉接种3361选择i0日龄11日龄发育良好的SPF鸡胚，在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区，用开孔器开窗备用。3362在无菌条件下，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚静脉接种01 mL，接种后用擦镜纸封口，置335培养。3363逐日观察并记录，24 h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，将48 h后死亡的鸡胚收置4冰箱保存，于接种后第6天同未死亡鸡胚一起收毒。337收毒在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳膜、尿囊膜、羊膜后，取出胚体，置平皿
7、中，在每个胚体上取若干组织块(有病变时，取病变组织)，置组织捣碎器或乳钵中研磨后，按1：5加入BLP(含青霉素2 000 IUmL、链霉素2 000tgmL)，置4冰箱浸提4 h，当日使用，剩余样品置一70保存备用。338接种敏感细胞3381 按常规方法在12孔细胞培养板上制备c636细胞单层。3382将收获的鸡胚上清液，接种细胞单层，每份病料接种两孔，每孔接种01 mL，置25培养，第2天换液后，培养7 d。3383按常规方法在12孔细胞培养板上制备BHK。，或Vero细胞单层。3384第7天用吸管吹下被接种的c636细胞。3385将吹下的C636细胞悬液接种于BHK：。或Vero细胞单层，
8、37吸附1 h后，加入维持液置37培养。24 h后逐日观察细胞病变，连续观察7 d。如盲传两代出现细胞病变，则应进行荧光抗体、PCR试验进行鉴定；如无细胞病变，则判定为病毒分离阴性。4蓝舌病病毒鉴定41 荧光抗体试验(直接法)411材料荧光标记的蓝舌病病毒单克隆抗体。412设备与器材倒置荧光显微镜、96孔细胞培养板。413试验程序4131将接种的BHK：，或Vero细胞培养物冻融一次，1 000 rmin离心10 rain，取上清液接种于带有玻片的24孔组织培养板的BHK：。或Vero细胞单层。每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，37吸附1 h后加入维持液，置37培养72 h。4132取出
9、培养板中的玻片，用001 molL PBS漂洗一次，预冷丙酮固定15 rain。4133每片滴加荧光标记的蓝舌病病毒单克隆抗体，使其覆盖于玻片，置暗湿盒中于37作用30 min。4134用001 molL PBS洗片三次，再用蒸馏水洗片一次。4135风干，用碳酸缓冲甘油(配方见附录A)封片，荧光显微镜检查。2GBT 18089-20084136结果判定：阳性对照的细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光，阴性对照应无荧光或无特异性荧光时，被检病毒接种细胞的细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性。42 聚合酶链反应(RT_PcR)421试剂和材料4211引物(25 pmolgL)：扩增NSl蛋白编码
10、基因RNA6保守序列，其引物序列和在RNA6基因中的位置如表l所示。表1编号 引 物 在RNA6中的位置1 5一GTTCTCTAGTTGGCAACCACC 3 10302 5 7 AAGCCAGACTGTTTCCCGAT_3 2832643 5一GCAGCATTTTGAGAGAGCGA_3 1701894 5 r CCCGATCATACATTGCTTCCT一3 2702504212 Trizol。4213 AMV(13 UpL)或MMuLV(200 UuL)。4214 dNTPs(每种浓度均为10 retoolL)。4215 RNA酶抑制剂(40 UpL)。4216 Taq酶(5 UpL)。4
11、217 RTPCR和PCR缓冲液。4218氯化镁(25 mmolL)。4219 电泳缓冲液(TBE)：配方见附录A。42110溴化乙锭溶液(10 mgmL)：配方见附录A。42111 DEPC水：配方见附录A。42112琼脂糖。42113 DNA分子质量标准。42114随机引物(25 mmolL)。42115三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等均为分析纯。422主要仪器和设备高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶电泳仪、水平电泳槽、凝胶管理系统、微量移液器。423试验程序4231样品的采集与处理不同样品参照432435的处理方法。4232对照样品制备42321 阳性样品：接种病毒的细胞培养物。42322阴性样
12、品：正常细胞培养物。4233 RNA的提取除本标准规定的方法外，也可采用其他等效的RNA提取方法，具体操作见有关试剂说明书。42331取250 pL处理后的样品置15mL Eppendorf管中，作好标记，加入3倍体积Trizol，振荡混合20 s，静置5 rain。42332加入200 pL三氯甲烷，振荡混合20 s，静置5 rain。42333 412 000 rmin离心15 rain，取上清置另一个标记好的15 mL Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，一20静置15 min。42334 412 000 rmin离心15 rain，轻轻弃上清，加l mL DEPC水配制的75乙醇
13、；43GBT 1 8089-200812 000 rmin离心15 rain，小心弃去乙醇，倒置滤纸上，烘干，立即进行eDNA的合成或一20保存备用。4234 eDNA的合成以下所有操作应在冰盒上进行。42341 RNA的变性在沉淀核酸的Eppendor管中依次加入：随机引物，2 pL；DEPC水，12 pL。轻微振荡，瞬时离心；70作用10 rain，冰浴2 m1tt；3 000 rmitt，离心1 rain。42342反转录在超净台内于Eppendorf管(42341)中依次加入：5反转录酶缓冲液，4“L；dNTPs，1 btL；RNA酶抑制剂，o5 pL；AMV反转录酶，05 pL。瞬时
14、离心，42作用1 h；70作用15 min；冰浴3 min，立即进行PCR扩增或一20保存备用。4235 PCR反应在一PCR管中，依次加入以下试剂：10PCR缓冲液，5 gL；氯化镁，3吐；dNTPs，1zL；TaqDNA聚合酶，05弘L；引物1，1 pL；引物2，1 pL；cDNA，4 tzL；ddH。O，345肛L。瞬时离心，置PCR仪内运行下列程序：95预变性3 min；9530 S，5530 s，7230 S，运行35个循环；72，10 min；4，保存。套式PCR扩增(Nested PCR扩增)：在一PCR管中，依次加入以下试剂：10PCR缓冲液，5 pL；氯化镁，3吐；dNTPs
15、，1 tzL；TaqDNA聚合酶，05肛L；引物3，1弘L；引物4，1弘L；第一次扩增产物，15 pL；ddH20，37 pL。瞬时离心，置PCR仪内运行下列程序：95预变性3 rain；9530 S，5530 s，7230 S，运行30个循环；72，10 min；4，保存。4236 PCR产物的检测42361 15琼脂糖凝胶的制备见附录A。42362加载样品：取两次扩增产物各10止与载样缓冲液混合，分别加入凝胶孔中。恒压5 vcfn8Vcm，电泳30 min60 rain；紫外检测仪下观察结果、照像。4237结果判定42371第一次PCR扩增后，阳性对照应出现一条274 bp的DNA条带。阴
16、性对照和空白对照没有核酸条带。42372第二次PCR扩增后，阳性对照应出现一条101 bp的DNA条带。阴性对照和空白对照没有核酸条带。42373在阳性样品第一次PCR扩增或第二次PCR扩增出现目的核酸条带，而阴性对照和空白对照均成立的情况下，进行检测样品的判定。42374待检样品第一次扩增经电泳出现274 bp的DNA条带，或第二次扩增经电泳能出现101 bp的DNA条带，均可判为阳性。42375待检样品两次扩增经电泳均未出现DNA条带，判为阴性。或者出现的条带不是274 bp和101 bp，为非特异性反应，需重复试验，两次试验均为非特异性反应时，判为阴性。5蓝舌病病毒血清中和抗体检测51试
17、剂和材料511病毒：蓝舌病病毒124血清型国际标准毒株。512对照血清：蓝舌病标准阳性血清、阴性血清。513被检血清：采集绵羊等反刍动物血液所分离的血清，-20保存。514细胞：C636、BHK或Vero。4GBT 1 8089-2008515培养液：配方见附录A。516维持液稀释液：配方见附录A。52设备与器材二氧化碳培养箱、冰箱(-20保存血清，一70保存种毒)、倒置显微镜、96孔细胞培养板、单头和多头微量移液器(20“L200 pL)。53试验程序531病毒繁殖将蓝舌病病毒124(BTV。)型分别接种于BHK。或Vero细胞单层，37吸附l h后加人维持液，置5二氧化碳(CO。)培养箱培
18、养，逐Et观察。待CPE达75以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以2 000 rmin离心20 min，分装成1 mL瓶，置一70保存备用。532毒价测定将各型病毒在96孔板上作10。10_1。稀释，每个稀释度作8孔，每孔病毒悬液为50 pL，加入细胞悬液150 pL(每毫升3X105个细胞)，每块板设8孔细胞对照。置5CO。培养箱37培养，逐日观察并记录CPE。按Karber方法计算出各血清型病毒的TCIDso50 pL。533灭能蓝舌病标准阳性血清、阴性血清、被检血清经5630 min灭能。534对照细胞对照：设4孔正常细胞对照，即每孔加细胞悬液100 pL(每毫升3105个细胞)、稀释
19、液100“L。一一一阴性血清对照：设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100 TCID。50 pL病毒悬液各50 pL，再加入细胞悬液100 pL(每毫升3 X 105个细胞)。病毒回归对照：将各型病毒稀释成1 000、100、10、1 TCIDs。50IL，每个稀释度作4孔，每孔加入50 pL病毒悬液，再加入细胞悬液100 vL(每毫升3105个细胞)，每孔补充稀释液50 pL。一阳性血清对照：将阳性血清分别作1：4、1：8、1：16稀释，每个稀释度作4孔，每孔加各稀释度阳性血清和lOO TClDs。50 gL病毒悬液各50 pL，再加入细胞悬液100儿(每毫升3X105个细胞)。血清毒性对照：
20、每份被检血清应按稀释度各设一孔毒性对照，每孔各加各稀释度血清50 pL、稀释液50 pL和100 pL细胞悬液。535中和试验5351将每份被检血清作1：4、1：8、l：16稀释，每个稀释度作5个孔，每孔加各稀释度血清50肚L。5352第1孔作为血清毒性对照，加入稀释液50 pL和细胞悬液100 pL(每毫升3105个细胞)。5353第2孔第5孔为正式试验孔，每孔加入病毒悬液50tL(100TCIDsoso pL)，振荡3min5 rain，置37中和1 h；加细胞悬液100 pL(每毫升3105个细胞)。5354置37、5CO。培养箱培养，24 h后逐日观察CPE并进行记录，培养7 d。53
21、55结果判定：当病毒回归1 000、100、10 TCID；。50 pL全部出现CPE，1 TCIDs。50止出现50CPE，阳性、阴性、正常细胞、血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，判定时间为72 h168 h。被检血清孔50出现保护，判为阳性，如低于50判为阴性。当某份血清的某一稀释度出现50保护时，该血清稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。当中和抗体滴度1：8时判为阳性。6蓝舌病病毒感染检测综合判定标准在检测中，蓝舌病病毒分离、鉴定与血清中和抗体试验应同时进行，任何一种方法为阳性，均可判定为蓝舌病阳性。5GBT 1 8089-2008A1 001 molL PBS，pH72pH74磷酸氢
22、二钠磷酸二氢钠氯化钠蒸馏水附录A(规范性附录)溶液配制A2乳糖蛋白胨缓冲液肉汤(BLP)A21 A液的配制磷酸二氢钠(无水)三蒸水A22 B液的配制磷酸氢二钠(无水)三蒸水A23工作液的配制A液B液蛋白胨乳糖103430j Pa 15 min高压灭菌或抽滤除菌。A3碳酸缓冲甘油A31 05molL pH95碳酸缓冲液的配制碳酸氢钠碳酸钠(无水)蒸馏水A32甘油。A33碳酸缓冲甘油的配制1份碳酸缓冲液加9份甘油混合即成。A4 5Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液Tris硼酸05 molL EDTA(pH80)三蒸水定容至充分溶解，4保存。A5 10 mgmL溴化乙锭溶液警告本品为强致癌物，使用时
23、需小心溴化乙锭三蒸水6119 g022 g850 g1 000 mL460 g500mL940 g1 000 mL220mL780 rflL200 g100 g370 g060 g100mL540 g275 g20 mL1 000 mLl g100mLGBT 18089-2008置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器，保存于室温。A6 DEPC水于三蒸水中按01加入DEPC，室温静置过夜，1034i05 Pa高压20 min，冷却备用。A7 15琼脂糖凝胶的制备在200mL三角烧瓶中加入：电泳级琼脂糖，15 g；05TBE缓冲液，100mL。置微波炉中使之完全溶解后，加入i0 mgmL溴化乙锭溶液5 pL充分摇匀，备用；待琼脂糖冷却到60左右，倒人制胶板并防止气泡产生，使琼脂糖厚度达3 mm5 mm；待凝胶完全凝固后去掉梳子和两端封口物，将凝胶托盘放人电泳槽，加入05TBE电泳缓冲液使之高出凝胶2 mm3 mm。A8营养液199培养基，加入含lo无蓝舌病病毒抗体胎牛血清；抽滤除菌。A9维持液199培养基，加入含2无蓝舌病病毒抗体胎牛血清；抽滤除菌。A10细胞分散液胰酶 25 g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)02 g无钙镁PBS 1 000 mL抽滤除菌。
