1、ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 21675-2008 非洲马瘟诊断技术Diagnostic techniques for African horse sickness 2008田04-09发布2008-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也世中国国家标准化管理委员会.()(.1 IJ 前言本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口，本标准起草单位2中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人=包静月、王淑娟、吴健三、王志亮、宋翠平、封启民。GB/T 21675-2008 I G
2、B/T 21675-2008 I -E司非洲马瘟(Africanhorse sickness，AHS)是马科动物的一种非接触性传染的病毒性传染病。由呼肠孤病毒科环状病毒属的非洲马瘟病毒(AHSV)引起，以呼吸系统和循环系统变化为特征，常使马、骤致死囚至少有两种库朦属节肢动物传播本病。该病有9个血清型。中华人民共和国动物防疫法将本病列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。本标准诊断技术内容包括临床症状、病理变化、病原鉴定和血清学试验。本标准主要参考OIE(哺乳动物、禽、蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册)(2000年版)，并结合我国的研究成果制定的。E GB/T 21675
3、-2008 非洲马瘟诊断技术1 范围本标准规定了非洲马瘟(AHS)的临床诊断、病原鉴定和血清学试验技术的要求。本标准适用于马、骤和其他马科动物非洲马瘟的检疫。2 临床症状2. 1 最急性型或肺型症状急性发作，潜伏期3d-5 d，特征为严重的渐进性呼吸道症状，初期仅显发热反应，最高体温可达40(:-41(: ，持续1d-2 d就降至常温，之后出现不同程度的呼吸困难，可见前腿分开，头前伸，鼻孔扩大。通常出汗较多，最后可见瘟孪性咳嗽，同时从鼻孔流出泡沫样黄色液体，以其自身的浆液性液体而溺死E这种病型康复率不到5%。2.2 亚急性型或水E中型、心裂病初有发热反应(39(:-41 (:)。潜伏期7d-1
4、4 d o 发热持续3d-6 d，发热后期，出现特征性水肿。水肿首先出现于颈部、眶上窝和眼险，以后可扩展至嘴唇、西颊、舌部、下领骨间、咽喉区，有时皮下水肿从颈部至胸部不等，严重时胸部和肩部也出现水肿。晚期可见结膜和舌腹侧、皮下出血点。最后变得烦躁不安，死于心力衰竭。一般在发热反应后4d-8 d内死亡，死亡率约50%。康复动物于3d-8 d内水肿逐渐消失。2.3 急性或混合型肺型和心型混合存在，临床不多见。潜伏期5d-7 do病初肺部有轻微症状，然后头部和颈部出现明显水肿，最后死于心力衰竭。或先出现亚急性型症状，然后突发最急性型典型呼吸困难和其他临床表现。通常发热后3d-6 d死亡，死亡率超过8
5、0%。2.4 最温和型潜伏期5d-14 d，后期表现弛张热(39(:-40(:)，持续5d-8 d。可能出现结膜轻度出血、脉搏加快、轻微厌食和精神抑郁。其他临床症状不明显，3 病理学诊断最特征及最常见的病变是皮下和肌肉组织间胶样浸润，并以眶上窝和喉头尤为显著。胃底霜膜肿胀一直延伸到j小肠前部。咽、气管、支气管充满黄色浆液和泡沫，肺泡、胸膜下和肺问质水肿，约有2/3病例有急性水肿。亚急性病例，头部、颈部和肩部水肿严重。心内膜和心包膜有血点和出血痕斑、心肌变性。有些病例胸腔和心包积存大量黄白色红色液体，淋巴结肿大、肝和胃出血。4 实验室诊断4. 1 病原分离和鉴定4. 1. 1 试剂4. 1. 1
6、. 1 磷酸盐缓冲液(PBS)(见B.1. 2)。4. 1. 1. 2 含有青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)(见B.1. 4) 0 4. 1. 1. 3 50%甘泊-磷酸盐缓冲液(见B.1. 3)。4. 1. 1. 4 MEM(最低限度必需氨基酸营养液完全营养液(见B.2. 2)0 4. 1.1. 5 MEM维持液(见B.2. 3)。1 GB/T 21675-2008 4. 1. 2 样品采集发热动物取抗凝血，死亡动物取2g4g小块牌、肺和淋巴结，保存于4C或放人50%甘油磷酸盐缓冲液中，4c运送和保存。用含有青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)将组织块配成10%悬液后，供分离。4. 1.
7、 3 病毒分离非洲马瘟病毒(AHSV)可直接以仓鼠肾细胞(BHK-21)、猴稳定细胞(MS)和绿猴肾细胞(VERO)细胞系进行分离。肝素抗凝血液样品勿需稀释就可使用，将样品接种上述细胞，吸附60mn后，加入MEM维持液。若用牌、肺等组织病料，则需魔路d品省嘻毒案链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)或MEM完全营养液和j成10%的组织悬浮液。制管12d18 d可出躏喇病变效应(CPE)，如言传三代仍无CPE，则判为阴性。4. 1. 4 乳鼠分离AHSV可用Z窝1日出现神经症状a取发病感染率为100%。4. 1. 5. 1 器材PCR扩增仪，4. 1. 5. 2. 3 4. 1. 5. 2. 4 = 4
8、. 1. 5. 2. 5 4. 1. 5. 2. 6 4. 1. 5. 2. 7 4. 1. 5. 2. 9 4. 1. 5. 2. 10去4. 1. 5. 3 操作方法4. 1. 5. 3. 1在4. 1. 5. 3. 2 4. 1. 5. 3. 3 4. 1. 5.3.4 12000 r/mn,15 min，4C。2 d5 d, 4. 1. 5. 3. 5 取上清到新的离心管中，加等体裸的异丙醇，混匀，静置10min。离心12000 r/min, 10 min，4C。4. 1.5.3.6 去上清，加入1mL 75%乙醇，离心12000r/min, 5 min，4C。4. 1. 5. 3.
9、7 按步骤4.1. 5. 3. 6重复离心一次E4. 1. 5. 3. 8 去上清，室温干燥RNA5 mino 4. 1. 5. 3. 9 加入100LDEPC处理过的水榕解RNAo4. 1. 5. 3. 10 每管RT-PCR扩增混合液体系的总体积为25L，其中含有12.5L2倍反应混合液、1L正向引物S7P1(lOmol/L)、1L反向引物S7P2(10mol/L)、1L反转录酶和Taq酶混合物、2 GB/T 21675-2008 3L从被检样品中提取的RNA和6.5LDEPC处理过的水。每份被检样品检测2次。每次检测设置标准阳性对照和标准阴性对照。标准阳性对照用阳性对照RNA作为模板，而
10、标准阴性对照用DEPC处理过的水作为模板。4. 1. 5. 3. 11 置于PCR扩增仪上进行RT-PCR扩增反应。RT-PCR扩增反应的条件如下:50C , 30 min进行反转录;94C, 2 min进行Taq酶的激活;40个循环的PCR(94C，1min, 55 C, 1. 5 min, 72 C ,2. 5 min) ;72C, 7 min延伸。4. 1. 5. 3. 12 扩增反应后，用1%的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，观察扩增片断大小。4. 1. 5. 3. 13 结果判定s如果阳性对照出现1179 bp大小的特异的扩增条带，阴性对照无任何扩增条带，说明检测结果成立。当该检测样品出现1
11、179 bp大小的特异的扩增条带，检测结果为RT-PCR检测阳性。4. 1. 5.3.14 序列测定和分析。RT-PCR检测阳性的扩增产物交付有关公司进行序列测定，序列测定的结果进行序列分析，如在GenBank(网址:http:/www.ncbi. nlm. nih. gov/blast/)中进行最相似序列搜寻(BLAST)，如果样品序列为特异的非洲马瘟病毒VP7基因序列，则说明受检样品检测结果为非洲马瘟病毒病原核酸阳性因4.2 血清学试验4.2.1 间接酶联免疫吸附试验(皿LISA)以重组VP7蛋白为抗原，检测AHSV抗体。4.2. 1. 1 器材ELISA反应板，酶联免疫吸附检测仪，加祥器
12、等。4.2. 1. 2 试剂4.2. 1. 2. 1 重组AHSV抗原。4.2. 1. 2. 2 包被液:0.05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液(见第B.ll章)。4.2.1.2.3 洗涤液z含0.05%吐温-20的pH7.4的PBS(见第B.13章。4.2. 1. 2. 4 封闭液及抗体稀释液z含3%牛血清白蛋白(BSA)的pH7.4的PBS(见第B.14章。4.2. 1. 2. 5辣根过氧化物酶抗马球蛋白结合物。4.2. 1. 2. 6 底物:A液、B液(见第B.15章)。4.2. 1. 2. 7 终止液:1 mol/L H, SO, (见第B.16章)或10%洗洁精(见第B.17章
13、。4.2. 1. 3 操作方法4.2. 1. 3. 1 抗原包被z将重组AHSV-4VP7以0.05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液包被液稀释，包被酶标板，40C孵育过夜。4.2. 1. 3. 2 洗板z以0.05%吐温20溶液(洗涤液洗酶标板5次，将酶标板在吸附材料上轻拍，除去剩余冲洗液。4.2. 1. 3. 3 封闭g以含3%BSA的pH7.4PBS封闭酶标板，200L/孔，于37C放置1ho 4.2. 1. 3. 4 弃去封闭液，将酶标板在吸附材料上轻拍。4.2. 1. 3. 5加待检血清和对照血清z将待检血清、阳性和阴性对照血清，以含3%BSA的pH7.4的PBS(抗体稀释液)按1
14、: 40稀释，每孔加入100L，37C培养1h。如测量抗体效价，将待检血清自1 : 40稀释开始，进行2倍连续稀释后，加入酶标板(100L/孔)，每排孔加一份血清，阳性和阴性对照做法相同。37C放置1h。4.2. 1. 3. 6 按步骤4.2.1.4. 2冲洗酶标板。4.2. 1. 3. 7 加酶标结合物=将辣根过氧化物酶抗马Y球蛋白结合物以含3%BSApH7. 4的PBS(抗体稀释液稀释，加入各孔(100L/孔)，370C放置1ho 4.2.1.3.8 按步骤4.2.1.4. 2洗酶标板。4.2. 1. 3. 9 加底物吉普液=按100L/孔加入新配制的底物溶液。3 GB/T 21675-2
15、008 4.2. 1. 3. 10 终止反应s约5min_ 1 0 min后，加入100L1 mol/L H2 SO.或10%洗洁精终止显色反应阴性对照开始显色之前)。4.2. 1. 3. 11 读数及结果判定=如果用1mollL H2SO.终止，于450nm判读结果P如果用10%洗沽精终止，于620nm判读结果。临界值的计算为阴性对照吸收值加0.6(0.6为用一组30份阴性血清获得的标准差)，如待检血清的光吸收值低于临界值判为阴性，如高于临界值+0.15判为阳性，如吸收值介于临界值和临界值十O.15之间则判为可疑，需采用另一种方法以证实这一结果。4.2.2 微量补体结合反应(MCF)微量补体
16、结合反应(MCF)检测AHSV4.2.2.1 材料4.2.2. 1. 1 含1%明胶的巴比4.2.2. 1. 2 血清样品4.2.2. 1. 3 抗原是备方法见附录A)。用4个8个单位。4.2.2. 1. 4 补体(4.2.2. 1. 5 4.2.2. 1. 6 4.2.2. 1. 7 4.2.2. 1. 8 对照血清。4.2.2.2 4.2.2.2.1 a) 血清和b) 血清和c) 分别加有d) f) g) SRBCso 4.2.2.2.2 4.2.2.2.3 4.2.2.2.4 将徽章板以1000r/min离心5mino 4.2.2.2.5 记录所有孔的溶血情况。以50%溶血作为终点读取结
17、果。4.2.2.2.6 结果判定试验成立的条件=当空白对照孔g)完全不溶血(十十+);一补体对照孔。完全溶血(-); 一一其他各项组合对照孔a)、b)、c)、d)、e)完全溶血一)，说明试验结果成立s62 C ，灭活30mino 的未感染鼠脑(1IJ ，在试验中，使SRBCs制备的离心一与CF抗特异性结合补体的血清最高稀释度的倒数即为其效价。效价1/10或更高为阳性，低于1/10为阴性。4 GB/T 21675一-2008附录A(规范性附录)非洲马瘟MCF抗原的制备方法抗原制备采用藤糖丙酣抗原，其方法是2将感染鼠脑加人4倍量8.5%直在糖(冷)溶液，置玻璃研磨器中充分研磨后，徐徐滴加到20倍(
18、冷丙酬内，边加边搅拌，静置15min后，弃卖点精吻帽带平部运牵挂红色胶状沉淀物，再加入20倍(冷)丙隅，充分搅拌，冰浴1h以上，去上清犀葡)，将沉淀物置于干燥器商、回真空泵拍干呈均匀粉末，加入相当于匀浆总量的0.4倍的巴比革:冲液(BB蜘附嚎唱略中置4C源将中过夜，置玻璃研磨器中充分研磨后，经3000 r/min3 5Qfrin襄嗒1h，取上清液，置4.C城篇保存用作抗原对照的健康鼠战成酌1Bl亦同样按庶糖-丙隅法处理J5 铀的国晖向国GB/T 21675-2008 B.l 磷酸盐缓冲液(PBS)B. 1. 1 0.1 moI/L PB晴氯化销(NaCl)氯化饵(KCl)磷酸二氢饵(KH，PO
19、，)磷酸氢二锅(Na，HPO，)附录B(规范性附录)试剂的配制80.0 g 2.0 g 30.0 g 2.0 g 双蒸馆水(ddH，O)1 000 mL 103 kPa高压蒸汽灭菌30mino室温或4C冰箱保存。B. 1. 2 0.04 moI/L PBS(pH7. 2-7.的O. 1 mol/L PBS 双蒸馆水(ddH，O)103 kPa高压蒸汽灭菌30mino室温或4C冰箱保存回B.1.350%甘泊-磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)400 mL 600 mL O. 04 mol/L PBS与纯甘池(分析纯等量混和，调整pH至7.4分装为小瓶，经103kPa高压蒸汽灭菌30min，室温或
20、40C冰箱保存。B. 1. 4 加青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2-7. 4) 加人终浓度100IU/mL青霉素和100g/mL链霉素的0.04mol/L PBS(pH7. 27.份。B.2 MEM完全营养液和维持液B.2.1 MEM(最底限度必需氨基酸营养液)基础营养液MEM干粉9.5 g 2.2 g 加至1000mL 碳酸氢销蒸馆水(dH，O)溶解后过滤除菌，4c保存。B.2.2 MEM完全营养液(pH7.2)MEM基础营养液中加下列成分使达到最终浓度210%灭活棋牛血清;100 IU/mL青霉素及100g/mL链霉素32 mmol谷氨酸氨。B.2.3 MEM维持液(pH7.
21、2)MEM基础营养液中加下列成分使达到最终浓度$10%灭活棋牛血清g100 IU/mL青霉素及100g/mL链霉素;2 mmol谷氨酸氨EB. 3 200 mmoI/L L-g1ntanin (谷氨黠氨)溶液母液6 谷氨酸氨(L-glutamine)双蒸馆水(ddH，O)2.923 g 100 mL B.4 75%Z醇元水乙醇DEPC处理过的水B.5 DEPC处理过的水DEPC 去离子水Tris碱砌酸B. 7 1 称取0.5g 60C时加入2.5B. 8.1 配方氯化销NaCl(分析纯)氯化续(MgCl， 6日，0)氧化钙CaCl，(分析纯)巴比妥(化学纯)巴比妥销化学纯元离子水B.8.2 配
22、法75 mL 加至100mL 1 mL 2.00 g 2000 mL GB/T 21675-2008 ，冷却至50C 将巴比妥加入500mL元离子水内，加热溶解后再加入其他成分和适量元离子水溶解后，无离子水加至2000mL.分装.103kPa高压灭菌20min，冷却后置冰箱内保存备用。l自用时稀释5倍。B.9 1%朋胶巴比妥缓冲液B.9.1 配方明胶5.0 g 7 GB/T 21675-2008 BBS 500 mL B. 9. 2 配法将明胶溶于30mL 35CBBS中，然后将其余BBS加人，混匀备用。B.l0 阿氏液B. 10. 1 配方葡萄糖氯化销拧橡酸销元离子水B. 10.2 配法24
23、.60 g 5.04 g 9.60 g 1200 mL 将试JfiJ榕化后，过滤，分装成6瓶，用70kPa灭菌20min，置4C冰箱保存备用。B. 11 包被液-一一O.05 moI/L pH9. 6碳酸盐缓冲液碳酸销碳酸氢销去离子水用0.22m膜过滤除菌，室温保存备用。B. 12 pH7.4 PB咀氯化纳0.318 g 0.588 g 200 mL 8.00 g 氯化饵0.20 g 磷酸氢二销CNa，HPO，. 12H20) 2.9 g 磷酸二氢饵CKH2PO，)0.20 g 加去离子水900mL，用盐酸调pH至7.4，然后定容至1000mL, B. 13 洗涤液一含0.05%吐温-20的p
24、H7.4的PBS吐温-20pH7.4 PBS B.14 封闭液及抗体稀释液-一一含3%BSA的pH7.4PBS 牛血清白蛋白CBSA)pH7.4 PBS 封闭液应现用现配。B.15底物B. 15. 1 A液8 磷酸氢二锅CNa，HPO,) 拧橡酸过氧化氢尿素去离子水0.5 mL 1000 mL 3 g 100 mL 3.682 g 1. 021 g 0.06 g 100 mL 避光4c 8C保存，尽量现用现配。B. 15.2 B液拧橡酸EDTA(乙二胶四乙酸TMB(3，3七二氨基联苯胶去离子水1. 05 g 14.6 mg 25.0 mg 100 mL 用。.45m滤膜过滤，避光4C8C保存，尽量现用现配。B. 15.3 用法使用时，将A液、B液按1 1的比例混合。B. 16 1 moI/L H280, 浓硫酸去离子水将浓硫酸缓缓加到蒸馆水中，t昆匀。B.17 10%洗洁精洗洁精去离子水混匀备用。5.5 mL 94.5 mL 10 mL 90 mL GB/T 21675-2008 9
