1、ICS 13.300;1 1. 100 A 80 中华人民共和国国家标准G/T 21767-2008 体内哺乳动物肝细胞非程序性DNA合成(UDS)试验方法化学晶Chemical-Test method of unscheduled DNA synthesis (UDS) test with mammalian Iiver cells ln Vivo 2008-09-01实施2008-05-12发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检蔑总局中国国家标准化管理委员会警GB/T 21767-2008 前言本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.486 (1997)c英文版)
2、。本标准作了下列编辑性修改z一一增加了范围部分;一一删除了OECD的参考文献部分z一一将OECD原文的简介与试验方法原则合井。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位=广东出入境检验检疫局。本标准参加起草单位z上海出入境检验检疫局，本标准主要起草人z程树军、许崇辉、焦红、邱璐、陈谷峰、李健、潘芳、黎庆翔。I 1 范围化学晶体内哺乳动物肝细胞非程序性DNA合成(UDS)试验方法GB/T 21767-2008 本标准规定了化学品体内哺乳动物非程序性DNA合成试验的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于检测能诱发实
3、验动物肝细胞DNA损伤和修复的化学物质。2 术语和定义、缩略语2. 1 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1. 1 修复期细胞cells in repair 指净核银粒(NNG)高于本试验室历史阴性对照值的细胞。2. 1.2 净核银粒net Duclear grains(NNG) UDS试验中，用于定量测定放射自显影细胞内UDS活性的方法，通过核银粒数(NG)减去等于核面积的细胞质内银粒平均数(CG)来计算，即NNG=NG-CGo通常先计算每一个细胞的NNG，再将一个培养物或平行培养物中细胞的NNG汇总。2. 1.3 非程序性DNA合成unscheduled DNA synthesi
4、s(UDS) 化学物质或物理因素引起DNA受损后进行的DNA修复合成，与按细胞周期进展程序而发生的S期半保留DNA合成不同，称为非程序性DNA合成。2.2 缩畸语下列缩略语适用于本标准。EINECS (European Inventory of Existing Commercial Chemical Substances):欧洲现有商业化学品目录NG(nuclear grains) :核银粒数CG(cytoplasmic grains) :细胞质银粒数3 试验基本原则体内哺乳动物非程序性DNA合成试验的目的是为了鉴定能诱发染毒动物肝细胞DNA修复的物质。体内试验提供了一种研究化学物质肝脏遗传
5、毒性效应的方法，测试的终点表明肝细胞发生DNA损伤及随后发生的修复。肝脏是机体吸收的化学物质代谢的主要器官，因此肝脏是检测体内DNA损伤的适宜部位。化学或物理因素诱发DNA损伤后，细胞启动非程序性DNA合成程序以切除或移除DNA损伤的区域，体内哺乳动物肝细胞UDS试验就是检测受损DNA的修复合成过程。肝细胞周期中处于S期的频率很低，因此试验通常用放射自显影技术检测氟标记的胸腺暗睫脱氧核背eH-TdR)掺入肝细胞GB/T 21767-2008 DNA的吸收量。与液体闪烁计数(LSC)法相比，放射自显影技术对S期细胞的干扰不敏感。4 试验方法4. 1 试验前考虑因素4. 1. 1 如果有证据表明受
6、试物质不会作用于靶器官，则不适用于本试验。4. 1.2 非程序性DNA合成(UDS)试验的终点是通过测定未进行程序性DNA合成的(S期)细胞内，被标记的核昔的吸收量决定的。最广泛使用的技术是通过自显影方法测定3H-TdR的摄人量.大鼠肝脏是最适宜用于UDS试验的器官，也可使用除肝脏以外的其他组织，但本方法只适用肝脏进行操作。4. 1. 3 UDS反应的测定取决于损伤部位被切除和取代的DNA碱基数的多少。因此，本试验最适合用于检测能引起的长片段修复(20-30对碱基)的受试物，而检测短片段修复(1-3个碱基的敏感性较低。而且，致突变事件也可能由于DNA损伤的未修复、错配修复或错误复制的结果引起，
7、因此，UDS反应的程度并不是修复过程的真实反应。此外，除DNA损伤以外的DNA致突变反应的修复也可能并不是通过剪切修复过程完成。本试验检测终点是测定全基因组，因此可以通过提高检测终点的敏感性，补偿由于UDS试验提供的致突变活性特异性信息的不足。4.2 准备4.2. 1 动物选择通常采用大鼠，也可使用其他哺乳动物。应当使用常用品系、刚成年的健康实验动物。试验开始时，动物体重偏差应当尽量减小，个体动物体重的偏差不应超过同种性别平均体重的土20%。4.2.2 饲养条件实验动物房的温度应当维持在22C士3C，动物房相对湿度应当维持在30%-70%之间，除非在清洁动物房时，相对湿度最好控制在50%-60
8、%之间。光照采用人工照明，12h明暗交替控制。饲以常规实验室饲料，不限饮水。如果受试物掺入饲料进行染毒，所用饲料应保证与受试物充分混匀。动物可单笼饲养或同性别小量动物同笼饲养。4.2.3 动物准备健康刚成年动物随机分为对照组和染毒组。饲养笼具也应随机安排，使饲养笼具放置可能造成的影响尽量减小。每只动物单独标记，试验前动物应在笼具中至少饲养5d，以适应实验环境。4.2.4 受试物制备4.2.5 固体受试物应溶解于或混悬在适合的溶剂或赋形剂中，并在动物染毒前稀释至一定浓度。液体受试物可直接使用或在染毒前予以稀释。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须有稳定性资料证明贮备液可以使用。4.3 试验条件4
9、.3. 1 榕剂/赋形剂所使用的溶剂/赋形剂的剂量水平不应产生毒性效应，不应与受试物产生化学反应。如使用未充分了解的溶剂/赋形剂，则应有证明其相容性的资料支持，建议在可能的情况下首先考虑使用水性溶剂/赋形剂。4.3.2 对照4.3.3 每个试验都应单独设置同时进行试验的阳性对照和阴性对照(溶剂/赋形剂)，除了不施加受试物染毒之外，对照组动物与染毒组动物都应以相同的方式进行操作。4.3.4 阳性对照应当是已知能产生UDS的物质，该物质在暴露水平下应预期检测到超过本底值的UDS增高。需要代谢活化的用性对照物应当使用其产生中等效应的剂量进行试验。阳性对照剂量应使效应很清楚，但不应使观察者立即发现其为
10、阳性对照标本。阳性对照物的染毒途径可以不同于受试物的染毒途径。4.3.5 阳性对照物包括表1所列化学物质，其他合适的阳性对照物也可使用。GB/T 21767-2008 表1非程序性DNA合成(UDS)试验阳性对照化学物采样时间| 化学物早期采样(2h-4 h) I N二甲基亚硝胶(N-Nitrosodimethylamine)晚期采样(12h-16 h) I 2-乙酷氨基药(N-2-Fluorenylacetamide)(2-AAF) 4.4 试验过程4.4. 1 动物数量和性别CAS号62-75-9 53-96-3 EINECS号200-249-8 200-188-6 考虑到试验反应中自然存
11、在的生物学差异，应使用适当的动物数，每组至少3只可供分析的动物。如已积累了丰富的历史数据，则同时进行的阴性和阳性对照组仅需用1只或2只动物。如在进行试验时，已有研究资料表明同一品系采用相同的暴露途径，在不同性别之间的毒性元实质性差别，则试验使用单一性别(优先用雄性)动物即可。当人群暴露于受试物可能有性别特异性时(如某些药物)，则应选择适当性别动物进行试验。4.4.2 染毒程序受试物通常采用一次染毒。4.4.3 剂量水平通常至少设2个剂量组。最高剂量应当是产生明显毒性的剂量，在相同染毒方案下，高于此剂量的更高剂量水平可能会导致动物死亡，较低剂量一般为高剂量的50%-25%。在元毒性反应的低剂量下
12、具有特殊生物活性的物质(如激素和促细胞分裂剂)，其剂量设置比较特殊，需要根据具体物质来决定。如无合适的资料可用，需进行确定剂量范围的预试验，预试验应与正式试验在同一实验室，使用相同种属、品系、性别的动物和相同的染毒方案进行。最高剂量组也可以定义为肝内产生某些毒性效应指征(如产生致密的皱缩核)的剂量。4.4.4 限度试验如果单次染毒剂量、或同一天分2次染毒的剂量水平达到至少2000 mg/kg，未观察到毒性效应，而且如果与其结构上相关的化合物的资料表明受试物无预期的遗传毒性，那么不需要进行几个剂量的完整试验。除非人类暴露受试物的资料表明需要，才在限量试验中使用更高的剂量水平。4.4.5 染毒受试
13、物通常采用灌胃或合适的插管套管进行经口染毒，只要能够证明合理也可采用其他染毒途径。但是并不推荐腹膜内染毒的途径，因为这样可能使受试物不经过循环系统而直接暴露于肝脏，一次灌胃或注射染毒可以使用的液体的最大容积视动物个体体重的大小而定。体积应当不超过2mL/100 g。若使用更高体积的染毒量，应说明理由。除了刺激性或腐蚀性物质通常刺激性作用会随浓度的升高而加重外，应当通过调整浓度使受试物的体积差别降到最低，使所有剂量水平的受试物体积保持相同。4.4.6 肝细胞制备通常于动物染毒后12h-16 h制备肝细胞，除非在12h-16 h产生明显阳性反应的物质，一般必须另外增加早期采样时间(通常在染毒后2h
14、-4 h)。如果已有毒物代谢动力学资料证明，也可使用其他采样时间。通常采用胶原酶原位灌注肝脏，使新鲜分离的肝细胞贴壁于适宜的表面，以建立哺乳动物肝细胞的短期培养物。要求阴性对照动物的肝细胞的存活率应当至少在50%以上。4.4.7 UDS测定新分离的哺乳动物肝细胞通常在含3H-TdR(胸腺嘈睫脱氧核背)的培养液中培养适当长的时间，如3h-8h。在培养期未，去除培养基，将细胞再培养于过量末标记胸腺嘈院脱氧核昔的培养液中，以除去未掺入到细胞的放射性(冷示踪，colachase)。如果培养时间延长，则此操作不必进行。然后细胞再经淋洗、固定和干燥。载玻片标本浸泡于放射自显影乳胶液中，置于暗处如冰箱7d-
15、14 d)曝光、染色和银粒计数。每只动物制备2-3个载玻片标本.3 GB/T 21767-2008 4.4.8 分析制备的标本片应当有足够量的正常形态的细胞以满足UDS评价的需要，在显微镜下观察细胞毒性变化(如核固缩、放射标记水平的降低)。银粒计数前应对样本片进行编号，每只动物至少从2个标本片计数100个细胞，如果每只动物的计数少于100个细胞，应当说明理由。对S期细胞核不进行银粒计数，但应记录S期细胞所占的比例。应用适当的方法测定形态正常细胞的细胞核内和胞质中3H-TdR的掺人量，它是银粒沉积的依据。测定核内银粒数(NG)、与核面积相当的胞质内银粒数(CG).CG的数值可以取胞质内标记量最强
16、的区域，也可随机取靠近核周边的2，._，3个胞质内的银粒平均值。如果合理，也可采用其他计数方法如全细胞计数法)。5 试验数据和报告5. 1 结果处理应提供每张载玻片标本和每只动物的数据。而且所有的资料应当总结成表格形式。从每个细胞、每只动物、每个剂量和每个采样时间得到的NG数减去CG数计算出净核银粒(NNG)数。如果计算修复期细胞，j1d修复期细胞的定义应明确，并以历史数据或同步进行的阴性对照数据为基础来计数。计数的结果可以通过统计学方法评价，并应当在试验前对所用的统计学方法进行合理选择。5.2 结果的评价和解释5.2. 1 阴性和阳性反应的评价标准阳性反应z净核银粒(NNG)值高于根据实验室
17、历史对照资料预先设定的界限值;或NNG值显著高于同步进行的阴性对照的值。阴性反应zNNG值在历史对照的界限值范围内或低于界限值z或NNG值并不显著高于同步进行的阴性对照。5.2.2 鼓据的生物学关联应当考虑数据的生物学相关性，也即考虑动物间的差异、剂量-反应关系和细胞毒性等参数。统计学方法的使用应有助于对试验结果的评价。但是统计学意义不应作为判定阳性反应的唯一依据。5.2.3 可疑的情况虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，但是在少数情况下，所得到的资料不能对受试物的活性进行明确的判断，不管经过多次重复试验，结果仍然是意义不明或可疑的。5.2.4 结果解释哺乳动物肝细胞体内UDS试验阳性结
18、果表明，受试物在体内能引起哺乳动物肝细胞的DNA损伤，这一损伤能在体外经非程序性DNA合成修复。阴性结果表明，在试验条件下，受试物不能引起(由本试验确定的可检测到的DNA损伤。5.2.5 其他考虑因素应当讨论受试物到达体循环或特定靶器官(如系统毒性的可能性。5.3 试验报告试验报告应包括以下资料z5.3. 1 曼试物a) 鉴定识别性资料和CAS编号如己知hb) 物理性质和纯度z。与进行本试验相关的理化特性zd) 受试物的稳定性(如已知)。5.3.2 藩剂/赋形剂a) 溶剂/赋形剂选择的理由p4 GB/T 21767-2008 b) 受试物在榕剂/赋形剂中的溶解性和稳定性如已知)。5.3.3 试
19、验动物a) 所用动物种属和品系;b) 动物的数量、年龄和性别;c) 来源、饲养条件和饲料等zd) 试验开始时动物的个体体重，包括每组动物的体重范围、平均体重和标准偏差。5.3.4 试验条件a) 阳性和阴性溶剂/赋形剂对照;b) 剂量范围确定试验的资料(如进行); c) 选择剂量水平的理由zd) 受试物制备操作的细节ze) 受试物染毒操作的细节Ff) 染毒途径的选择理由zg) 证明受试物至u达体循环或靶器官的方法(如进行); h) 从饲料/饮水中的受试物质量分数(mg/kg)换算成实际剂量mg/(kg d) 的方法(如进行hi) 饲料和饮水质量详细检测报告zj) 染毒和采样方案的详细描述:k)
20、毒性测定的方法zD 肝细胞制备和培养方法zm) 放射自显影方法Fn) 制备的标本片数量和计数的细胞数20) 评价标准;p) 判断结果为阳性、阴性或可疑的标准。5.3.5 结果a) 每个标本片、每只动物和每组NG、CG和NNG的平均值zb) 剂量-反应关系如可能hc) 统计学分析如有使用hd) 毒性表现Fe) 同步进行的阴性对照(溶剂/赋形剂和阳性对照资料Ff) 历史阴性对照(榕剂/赋形剂)和阳性对照资料，包括范围、均数和标准偏差zg) 修复期细胞数(如测定); h) S期细胞数(如测定); i) 细胞存活率。5.3.6 结果讨论5.3.7 结论5 DON-hhFNH国。华人民共和国家标准化学晶体内哺乳动物肝细胞非程序性DNA合成(UDS)试验方法GB/T 21767-2008 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数11千字2008年7月第一次印刷开本880X12301/16 2008年7月第一版* 书号:155066 1-32176 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有僵权必究举报电话:(010)68533533
