1、ICS 13.300; 11. 100 A 80 中华人民共和国国家标准GB/T 21768-2008 化学晶体外哺乳动物细胞DNA损伤与修复/非程序性DNA合成试验方法Chemical-Test method of DNA damage and repair/unscheduled DNA synthesis with mammalian cells in vitro 2008-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2008-09-01实施发布GB/T 21768-2008 目。本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.482(19
2、86年)(体外哺乳动物细胞DNA损伤与修复/非程序性DNA合成试验英文版)。本标准作了下列编辑性修改z增加了范围部分z一一-计量单位改成我国法定计量单位;一一删除OECD的参考文献部分。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位z中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准参加起草单位z广东出入境检验检疫局、天津市检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人=刘清君、程树军、许崇辉、任军、张园。I 1 范围化学晶体外哺乳动物细胞DNA损伤与修复/非程序性DNA合成试验方法GB/T 21768-2008 本标准规定了化学晶体外哺乳动物细胞DNA
3、损伤与修复非程序性DNA合成试验的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于检测能诱发哺乳动物细胞DNA损伤与修复的化学物质。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 程序性DNA合成schednled DNA synth臼is正常情况下，DNA合成仅在细胞有丝分裂周期的S期进行，称为程序性DNA合成。2.2 非程序性DNA合成nnschednled DNA synthesis(UDS) 化学物质或物理因素引起DNA损伤，切除和移除受损片段后进行的DNA修复合成。3 试验基本原则体外哺乳动物细胞非程序性DNA合成试验(UDS)描述了使用原代哺乳动物细胞或连
4、续细胞系检测DNA修复合成的操作方法。非程序性DNA合成的终点可以通过放射自显影技术测定放射性标记的核昔，如氟标记的胸腺喃睫脱氧核昔(3H-TdR)的吸收量来进行，也可或通过液体闪烁计数(LSC)法进行测定oUDS也可以采用体内实验系统进行测定。化学或物理因素诱发DNA损伤后，细胞启动非程序性DNA合成程序以切除或移除DNA受损区域，UDS试验就是检测受损DNA的修复合成过程。试验的原理是检测3H-TdR掺入非S期哺乳动物细胞DNA的量。通过DNA放射自显影技术或液体闪烁计数(LSC)的方法测定染毒细胞中3H-TdR的吸收量。除了采用原代大鼠肝细胞作为靶细胞外，培养的哺乳动物细胞均应在加和不加
5、外源性代谢活化系统两种情况下与受试物作用。4 试验方法4. 1 曼试物必备资料a) 物态z固体、液体或气体zb) 名称和识别码zc) 纯度(杂质); d) 溶解特性ze) 熔点/沸点sf) pH值(可测时hg) 蒸汽压资料(如果可提供。4.2 试验准备4.2. 1 曼试物受试物和对照物应当用细胞培养基制备，或先用适当的赋形剂溶解，使用时进一步用细胞培养基稀GB/T 21768-2008 释。赋形剂的终浓度不能影响细胞活性。4.2.2 细胞和培养条件原代培养细胞(如大鼠肝细胞)，人淋巴细胞或已建系的细胞(如人二倍体成纤维细胞都可用于本试验。选用适当的生长培养基、CO2浓度、温度和湿度维持细胞生长
6、培养。细胞系应定期检查有元支原体污染。4.3 试验条件4.3. 1 细胞培养的数量采用放射自显影技术检测UDS时，每个试验点至少需要2个或2个以上平行细胞标本。使用液闪技术检测UDS时，每个试验点至少需要6个平行细胞标本，如果有科学依据可适当减少细胞平行样的数量。4.3.2 对照每一次试验均应同时设置加和不加代谢活化系统两种情况下的阳性和阴性(溶剂)对照。用大鼠肝细胞进行试验时，阳性对照物可用7，12-二甲苯惠(7，12-DMBA)和各乙酷氨基药(2也AAF)。如果用细胞系，在元代谢活化系统的情况下，放射自显影和LSC检测均可用4-硝基哇琳-N-氧化物(4-NQO)作为阳性对照物;而在有代谢活
7、化系统的情况下，则用二甲基亚硝胶为阳性对照物。4.3.3 染毒浓度应选用多个浓度受试物进行试验，浓度应覆盖确定毒性反应的合适范围。受试物最高试验浓度应当会产生一定细胞毒性。相对不榕于水的受试物应以其能达到的最高溶解量进行试验。对于易溶于水的化学物质，应根据受试物具体情况确定试验最高浓度。4.3.4 代制活化除了本身具有代谢活性的原代培养细胞外，其他细胞均应在加和不加合适的代谢活化系统的情况下分别进行染毒。4.4 试验过程4.4. 1 培养物制备已建系的细胞可以直接从培养状态良好的培养物获得(如膜酶消化或吹打)，以适当密度接种于培养瓶中，37C培养。短期培养的哺乳动物原代肝细胞可通过新鲜分离的肝
8、细胞贴壁生长于支持物表面后获得。人淋巴细胞可采用适当的技术获得，如全血经淋巴细胞分离液分离。4.4.2 受试物处理培养物4.4.2. 1 原代哺乳类动物肝细胞用含有3H-TdR培养基的受试物对新鲜分离的哺乳类动物肝细胞处理适当时间。染毒结束时去除培养液，然后洗涤、固定和干燥，载玻片浸人放射自显影乳胶中(或用剥离乳胶片代替)，曝光、显影、染色和计数。另一种方法是用5-澳脱氧尿嘈睫核昔(BrdU)掺入到修复合成的DNA分子中以改变DNA分子重量的方法，经密度梯度离心后，能将复制中的DNA和UDS-DNA分离出来以进行液闪计数。这个技术不需要放射标记。4.4.2.2 细胞系和淋巴细胞，果用撞射自显影
9、检测用受试物处理细胞适当时间，染毒时间由受试物性质、代谢活化系统的活性和细胞类型决定。为了测定UDS的峰值，3H-TdR应与受试物同时加人，或者在受试物染毒开始后数分钟内加人。受试物和3H-TdR间可能存在的相互作用将会影响到这两种不同处理方式的选择，为了区分UDS和正常的DNA半保留复制，可采用精氨酸缺乏的培养基、低血清培养基或在培养基中添加起基廊的方法来减少或抑制正常的DNA半保留复制。GB/T 21768-2008 4.4.2.3 细胞系和淋巴细胞，采用LSC栓测UDS在用受试物处理细胞之前，应按上述方法处理细胞以阻止细胞进入S期z然后按照放射自显影技术所列方法(4.4.2.2)，用受试
10、物处理细胞适当时间。孵育期结束后，从细胞中抽提出DNA，测定DNA总量及掺入DNA的标记物数量。应当注意到，当选择淋巴细胞用于上述两种技术操作时，在非剌激培养中不需要抑制正常的DNA半保留复制。4.4.3 分析4.4.3. 1 自显影测定测定经受试物处理的培养细胞中的UDS，S期细胞核不计数。计数前玻片应编号，每个标本至少要计数50个细胞，在每张玻片上任意选择几个完全独立的视野，通过适当的方法测定掺入细胞质的3H-TdR量。试验结果应当通过重复试验验证。4.4.3.2 LSC测定每个试验浓度以及对照组均应当选6个细胞样本(如果有科学证据，可以减少)进行LSC测定。试验结果应当通过独立的重复性试
11、验验证。5 试验数据和报告5. 1 结果处理数据应当以表格的形式提交。5. 1. 1 自显影技术测定的数据应当分别记录细胞质内3H-TdR的掺入量和细胞核上的银粒数。可以用均数、中位数和总数描述细胞质内3H-TdR的掺入量和每个细胞核上的银粒数。含UDS细胞占细胞总数的百分比，可为结果判定提供信息。用适当的统计方法对数据进行评价。5. 1. 2 LSC测定的数据对于LSC的测定，3H-TdR的掺入量应以每分钟衰变数每微克DNA(dpm/，.，.gDNA)表示。平均dpm/gDNA及其标准偏差可用于描述掺入量的分布。用适当的统计方法对数据进行评价。5.2 结果评价阳性结果的判断标准有2个。一个是
12、放射性标记物的掺入量(以每个细胞核的银粒数表示或以dpm/gDNA表示具有剂量依赖性的增高，且与阴性对照相比具有统计学意义F另一个是受试物至少在一个测试点得到可重复且有统计学意义的阳性反应。如果上述两种情况均不存在，则认为受试物在该测试系统中的结果为阴性。5.3 试验报告试验报告应包括以下信息:(如果适用)a) 所用细胞名称、密度、染毒时的传代数和培养细胞数量Fb) 培养细胞的条件，包括培养基、温度和CO2浓度zc) 受试物、赋形剂，用于试验的受试物浓度及其选择依据zd) 代谢活化系统的详细描述Fd 处理过程;f) 阳性和阴性对照zg) 用于阻止细胞进入S期的方案;h) 采用的自显影技术zCON-hFNH阁。GB/T 21768-2008 液体闪烁计数法DNA提取过程及测定总DNA含量的方法;剂量-反应关系p统计学评价;结果讨论;m) 结果解释。川剧。侵权必究书号:155066.1-32177 版权专有
