1、ICS 13.到0;13.020.40A 80 昌中华人民共和国国家标准GB/T 21805-2008 化学晶藻类生长抑制试验Chemicals-AIga growth inhibition test 2008-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2008-09-01实施发布- 目U兰ZE习GB/T 21805-2008 本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.201(2006年)(藻类生长抑制试验以英文版。本标准做了下列编辑性修改2一一将计量单位改为我国法定计量单位。一一将原附录1术语和定义调整为正文。一-增加了普通小球藻(Ch
2、lorellaVulgaris)为受试生物。一一-将原附录4的内容调整到正文6.1.2藻类的储备培养和6.1.3藻类的预培养。一删除了原附录2中藻种来源相关内容。本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位z环境保护部化学品登记中心目本标准参加起草单位沈阳化工研究院安全评价中心、上海市检测中心、上海市环境科学研究院。本标准主要起草人s周红、营小东、马馨、蔡磊明、赵玉艳、戎志毅、沈根祥。I GB/T 21805-2008 化学晶藻类生长抑制试验1 范围本标准规定了化学晶藻类生长抑制试验的方法概述、试验准
3、备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本标准适用于测试试验条件下洛于水的化学品。如果要测试挥发性、强吸附性、有颜色、不溶或难溶于水的化学品，以及可能影响培养基中营养物质有效利用的化学品，需要对所述试验程序进行修改(如采用密闭系统、适当的试验容器。参考文献2J、3J和4J提供了部分修改方案。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准，2. 1 生物量biomass 单位体积试验介质内活体生物的干重，例如毫克藻每升试验溶液。生物量通常被定义为质量，但在本标准中，定义为单位体积的质量，且以单位体积内细胞数量或荧光性等的测定替代生物量的测定。2.2 变异系数coefficient of vari
4、ation 标准差与平均数之比，通常以百分比表示，记作cv%。变异系数是一个无量纲的数，因而便于样本间的相互比较J对照组各平行平均比生长率的变异系数的平均值按以下方式计算za) 分别计算试验各阶段各平行的平均比生长率;b) 计算试验各阶段对照组各平行平均比生长率的变异系数的平均值。2.3 效应浓度EC% 引起受试生物生长或生长率比对照下降x%(如50%)时的受试物浓度。EC有基于生长率的E，C和基于生长量的E，C之分。2.4 藻类生长培养基growth medium 含有特定营养成分的液体或胶状物质。藻类在培养基中生长并暴露于受试物。通常是将受试物溶于培养基中.2.5 生长率growth ra
5、te 即平均比生长率(averagespecific growth rate) ，是暴露期间藻类生物量的指数增长率。2.6 最低可观察效应浓度lowest observed effect concentration; LOEC 在一定暴露期内，与对照相比，对藻类生长有明显(p0.05)抑制效应的最低受试物设置浓度。高于LOEC的所有试验浓度均可观察到与LOEC时相同的或更严重的毒性影响。如果未满足上述条件，应就LOEC(以及NOEC)的选择进行详细说明。2. 7 无可观察效应浓度no observed effect concentration; NOEC 直接低于最低可观察效应浓度(LOEC)
6、的受试物设置浓度。1 GB/T 21805-2008 2.8 响应变量response variable 可替代生物量评价受试物对藻类的毒性的各种参数，如生长率和生长量，2.9 比生长率specific growth rate 试验期间，每天生物量的增长。生物量自然对数之差与时间之差的商。2. 10 生长量yield 试验期间，生物量增中藻类生物量之差。3 受试物信息4. 1 a) 结构式;b) 纯度5c) 蒸气压Bd) 水中溶解e) 正辛f) 水浴液g) h) k) 物量与试验开始时各试验容器的淡水绿藻和h、48h和72h藻类最低可观察效应浓度CLOEC)和或无可观察残d加凯NOEC)。虽然
7、试验周期相对较Jjr，但是是过藻类若干代的繁殖可以评价其效应。测定不同时间藻类的生物部量化赣椭嗣营所面。咀嚼类干重难以测定，多使用其他参数替代，如细胞浓度、荧光性和光密贺雀。应知晓所使用的弩约参数与生物量之间的换算系数。测定终点为生长抑制。可以试验期可平写啧到持想曾或军物量的增加来表达。从一系列试验浓度下的平均比生长率或生长量可以获得致使藻类生长率或生长量受到x%抑制(直日50%)的被试物质浓度，并表达为ErC.o;或EyC.C如ErC50或EyCso)0 4.2 参比物本标准使用3，5-二氯苯盼作为参比物口。对于绿藻，也可使用重错酸饵作为参比物。定期测试参比物对藻类生长的影响，至少每年两次。
8、5 仪器和设备5. 1 试验容器试验容器和其他与试验液直接接触的器皿应完全为玻璃或其他化学惰性材料制成，用于测试前应2 GB/T 21805-2008 彻底清洗并灭菌。试验容器为具有一定容积的玻璃瓶，如三角瓶，以保证试验期间有足够的试验液用于测试，同时也保证CO，的充分交换(要有一定的表面积-体积比，125mL三角瓶中试验液的体积应为40mL 60 mL, 250 mL三角瓶应为70mL100皿L，500mL三角瓶应为100皿L150mLo)注意必须保证有足够的液体用作分析测定e为了防止有机或无机污染物影响藻类的生长和培养基的组成，容器应用棉塞、海绵塞、滤纸、纱布C2层3层、锡?自纸等封闭，挥
9、发性化学品试验时应用磨口玻璃塞完全密封。同一批试验的容器应规格一致。5.2 培养设备使用可控制温度在土2(;范围内的光照培养箱，5.3 照度计测定光照强度的仪器z注意，光照强度的测定方法非常重要，使用不同类型的光接受器得到的结果可能不同。最好使用4的球面照度计(可接受来自各方向各角度的直射或反射光照或2球面照度计(可接受来自上方各角度的直射或反射光照。5.4 测定藻类生物量的仪器设备细胞计数是最常用的替代参数，用于计数的仪器设备主要有电子颗粒计数仪、显微镜、浮游植物计数框或血球计数板、手动计数器等。应明确细胞计数和干重之间的转换关系。也可使用分光光度计、比色计、荧光计、流动细胞计数仪等测定其他
10、替代参数。为了在低生物量时进行有效测定，使用分光光度计吸收池的光径必须至少为4cmo 5.5 其他仪器设备一一-pH计z电子分析天平;一一高压灭菌锅;一一机械振荡器等。6 试验准备6. 1 受试生物6. 1. 1 受试生物的选择选择一些不易附着于瓶壁上的绿藻和蓝藻作为受试生物。a) 绿藻一一羊角月芽藻CPseudokirchneriellasubcapitata); 一一栅藻(Desmodesmussubspicatus) ; 普通小球藻CChlorellavulgais)。b) 硅藻舟形藻CNaviculapelliculosa) 0 c) 蓝藻水华鱼腥藻CAnabaenaflos-aqua
11、e) ; 一一聚球藻CSynechococcusleopoliensis)。上述藻类的详细信息见附录Ao也可选用其他藻类，但应在报告中说明其品系和(或来源，并确保在试验期间相应的试验条件下保持指数生长，3 GB/T 21805-2008 6. 1. 2 藻类的储备培养得到纯藻种后，需要加以保存，以备试验时用。藻种可在试管内固体培养基斜面上保存。在培养基中加入0.8%的琼脂，灭菌后倒入试管，冷却成斜面，然后接种藻类，棉塞封闭，在较低光照和温度条件下可保存较长时间。大约每隔2个月转接一次。如果经常进行试验，储备培养物应在液体培养基中保存。在三角瓶中加入约100mL培养基，接种藻类，在试验要求的相同
12、温度和光照条件下培养，每周转接一次，以保持培养物生长良好，随时有足够的数量可用于试验.对于生长快速的藻类，接种量为转接前藻细胞浓度的1%。一般应在藻类进入生长停滞期前转接。应该经常检查储备培养中藻类届是情况，包括形态和生畏骂丘，以及有无茵类和其他藻类的污染。培养物有畸形生长或受到其j藻类或菌拳幽特噪喇唱国2废弃或采取纯化、复壮等措施。6. 1. 3 藻类的预培养自储备培养物中应使藻类在2d4 d 如畸形等)应废弃。6.2 试验条件6.2. 1 培养基使用OECD物在不当中范围400nm700 120E.m-2.s-1)。2 960 lx4 440 lx 士15%范围内。机械振荡器，(100士1
13、07 试验程序7. 1 制备7. 1. 1 受试物溶液的制备中的位提高培。光谱在光照强度为照强度差异应保持在如果受试物为易溶于水的化学物质，用经灭菌后的新鲜培养基配和j受试物的储备液，其浓度为测试时所需最高浓度的2倍。用此储备液稀释配制成一系列不同浓度的受试物浴液，其浓度也分别为测试时所需浓度的2倍。如果受试物为难溶于水的化学物质，用适当的溶剂，例如丙丽、丁基乙蹲和二甲基甲J!G胶2J.3等，制备受试物的储备液，其浓度应是测试时所需最高浓度的10倍。用此储备液稀释配制成一系列不同浓度的受试物溶液，其浓度也分别为测试时所需浓度的10倍。应选用对藻类生长元影响的溶剂，试验液中溶剂最大允许使用量为1
14、00问/L。4 GB/T 21805一刽087. 1. 2 藻液的制备镜检并计数预培养的藻类，若藻类生长良好即可用于试验。试验液中藻类的初始生物量干重应小于0.5mg/L，因此，各种藻类在试验液中的初始细胞浓度如下.a) 羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata) ,5 X (10 10)个/mL;b) 栅藻(Desmodesmussubspicatus) ，(25) X 10个/mL;c) 普通小球藻(Chlorellavulgaris )10个/mL;d) 舟形藻(Naviculapelliculosa) ，10个/mL;e) 水华鱼腥藻(Anabaenaf
15、los-aquae) ，10个/mL;f) 聚球藻(Synechococcusleopoliensis) ,5 X (10 10)个/mLo如果受试物为易溶于水的化学物质，藻液中的藻细胞浓度为初始细胞浓度的2倍z如果受试物为难溶于水的化学物质，藻液中的藻细胞浓度为初始细胞浓度。7. 1.3 试验液的制备如果受试物为易溶于水的化学物质，将受试物溶液和藻液以1 1的比例混合，即为试验液。对照组不加入受试物溶液而加入同体积的元菌培养基。如果受试物为难溶于水的化学物质，向一定体积的藻液中加入10L受试物溶液，即为试验液。增设溶剂对照组，其中加入10L溶剂，7.2 试验操作7.2.1 预备试验正式试验之
16、前，先进行较大范围浓度系列的预备试验，为正式试验设置受试物的浓度提供依据。预备试验不设平行。7.2.2 正式试验根据预备试验的结果进行正式试验，最好在对藻类产生5%75%生长抑制效应之间以几何级数设置受试物浓度系列。正式试验至少设5个浓度，浓度的间隔系数大于或等于3.2，每个浓度3个平行。如果试验不需要得出无可观察效应浓度(NOEC)，可以适当减少平行数而增加试验浓度。应同时设置空白对照组，若使用溶剂，还应增设溶剂对照组，对照组至少设3个平行。如果条件允许，对照组平行数为处理组的2倍。7.2.3 试验周期试验周期为72h。但如果为了满足质量保证与质量控制的各项要求，也可根据实际情况缩短或延长试
17、验周期。7.2.4 藻类生长情况测定试验开始后，每隔24h，即在24h、48h、72h 时，从每个试验容器中取样镜检并进行生长测定。吸取少量试验液进行测定，测定完成后，严禁将取出的试验液放回至试验容器中。测定项目包括藻细胞浓度、光密度或叶绿素等，测定方法如下=a) 细胞计数z在显微镜下，用0.1mL计数框或血球计数板对藻细胞的数量计数。用计数框时可采用视野法，即对显微镜视野中的所有细胞计数。放大倍数40X 10，每片至少计数10个视野，如果藻细胞密度小，则要适当增加计数视野，藻数按视野累加。每次计数(同一批取样的样品应采用相同方法(视野数目、放大倍数等。每一样品至少计数2次，如计数结果相差大于
18、15%，应予重复计数。如工作量过大，可先取样，用鲁哥氏液固定后保存，留待以后计数。镜检计数工作量较大，有条件时可采用电子颗粒计数仪。b) 光密度2取一定量的测试液在分光光度计上测定其光密度，波长可选用650nm、663nm或其他波长。亦可用荧光光度计测定。c) 叶绿素g样品经离心或过滤后，用丙阔、乙回事或其他洛JiiJ萃取，进行分光测定。亦可用荧光光度5 GB/T 21805-2008 计测定。7.2.5 分析检测试验开始和结束时，应测定对照组和各处理组试验液的pH值，pH值的差异小于1.50如果受试物是金属或混合物，且在试验的pH值左右发生部分离子化，那么必须限制pH值的偏移，以确保获得可重
19、复的试验结果。偏移小于0.5在理论上是可行的，并且可以通过确保有充足的CO，在空气和试验液间交换来实现，例如增大摇动频率。另一个途径是减少初始生物量或缩短试验周期来减少对CO，的需求。建立试验液中受试物浓度的分析测定方法，试验开始和试验期间定期取祥测定，以验证各处理组试验液的初始浓度以及试验期间的暴露浓度。如果试验期间受试物的浓度能维持在设定浓度(或初始测定浓度土20%的范围内，测定试验开始和结束时一个高浓度组、一个浓度组和约50%生长抑制浓度组试验液中受试物的浓度;如果不能，则测定各浓度组试验液中受试物的浓度。如果受试物具有挥发性、不稳定性或强吸附性，则每隔24h应测定一次，用于受试物浓度分
20、析的培养基应与试验用培养基经过同样的处理，即它必须接种了绿藻且在与试验相同的条件下培养。如果需要分析溶解的受试物浓度，必须将藻类从培养基中分离出来。最好使用离心法进行分离，较低转速就可使藻类沉淀，结果计算以测定浓度为准。如果测定浓度为设定浓度(或初始测定浓度)的80%120%，可以用设定浓度或初始测定浓度来计算，如果超出该范围，则使用测定浓度的几何平均值或受试物浓度下降的模型进行结果计算3.的。相对于其他绝大多数的短期水生生物毒性试验而言，藻类生长抑制试验是一个动态的试验系统。试验中实际的暴露浓度难以确定，尤其是对于强吸附性物质在低浓度时。因此，由于吸附于生物量增加的藻类上，试验液中被试物质的
21、消失并不意味着它从该试验系统中消失。结果计算时，须核查在被试物质浓度降低过程中是否伴随着藻类生长抑制效应的减小.如果发生此类情况，建议应用合适的被试物质浓度下降的模型。如果未发生此类情况，最好采用初始浓度(设定或测定的分析结果进行计算。7.2.6 试验观察试验结束时，镜检试验液中藻细胞生长是否健康正常，记录并说明细胞的任何异常情况，如畸形等(暴露于受试物中引起的。7.3 限度试验若预试验的结果表明，受试物在100mg/L的浓度下(或在试验溶液中的最大溶解度下，该溶解度大于100mg/L)对受试藻类没有产生任何可观察效应，正式试验可使用限度试验，限度试验的浓度为100 mg/L，如果受试物在试验
22、溶液中的最大溶解度大于100皿g/L，则取该最大溶解度作为限度试验的浓度。限度试验设6个重复，对照组与处理组应同时进行。所有上述有关试验条件和质量保证与质量控制的内容均适用于限度试验。对照组和处理组中测得的响应变量需用统计学方法进行比较分析，例如学生氏CStudent)t检验。如果两组所得变量不规则，应调整t检验的方法。8 质量保证与质量控制6 试验达到以下指标方为有效ga) 试验开始的72h内，对照组藻细胞浓度应至少增加16倍，即比生长率不小于0.92d-1。对于常用的试验藻种，生长率远高于此(见附录A)。如果试验使用了其他生长较慢的藻种，该指标可能不能被满足。如果发生此类情况，应延长试验周
23、期，直至对照组藻细胞呈指数增长且浓度增加16倍。同时，也可缩短试验周期，但至少应为48h且供给充足，同样应达到对照组藻细胞呈指数增长且浓度增加16倍。b) 试验各阶段，如odl d, l d2 d和2d3 d，对照组比生长率的变异系数的平均值小GB/T 21805-2008 于35%, c) 整个试验期间，对照组各平行的平均比生长率的变异系数，羊角月芽藻(PseudokirchneriellasubcaPi阳ta)和栅藻(Desmodesmussubspicatus)不大于7%，其他推荐藻类不大于10%。9 数据与报告9. 1 数据处理9. 1. 1 绘制生长曲线用测定的替代参数(如藻细胞浓度
24、、荧光性)表示试验容器中藻类的生物量。以表格形式列出24h、48h和72h对照组和各处理组的试验容器中的藻类生物量。以时间为横轴，藻类生物量为纵轴，取各平行的平均值，绘制对照组和各处理组的藻类生长曲线。对数坐标轴和直线坐标轴均可使用，但是用对数坐标轴作出的生长曲线是一条直线，其斜率就是藻类的比生长率，它可以更好地表达藻类的生长模式。观察生长曲线，检查试验期间对照组的指数生长是否达到预期的生长率。仔细检查所有数据点和相关图表，核对原始数据和可能产生误差的环节，仔细检查可能偏离系统误差的所有数据点。如果发现了明显的程序上的错误或该错误发生的可能性非常高，将相关的数据点标为异常值，并在进行下一步的统
25、计分析时剔除这些数据(如果其中一个平行中藻类的浓度为零，那可能是该平行试验液中未接人藻类或器皿的洗涤方法不正确。试验报告中对于作为异常值被剔除的数据应阐明其原因。可以接受的原因仅仅只限于程序上的错误和精密度差。判定异常值的统计学程序仅仅适用于此类问题，它并不能代替专家评审。最好在之后出现的图表中保留异常值。9. 1.2 参数计算本标准应计算以下参数以评价受试物对藻类的影响za) 比生长率=试验期间，每天生物量的增长，见式(1), 式中slnX，一lnX，f-Li-j =:=一叫一一从z时间ilJj时间的比生长率，单位为每天(d); X，-i时间的生物量;Xj一_J时间的生物量.对于各处理组和对
26、照组，计算各平行的平均值进行毒性评价。. ( 1 ) 采用初始接种生物量的设定值计算整个试验周期(通常od3心的平均比生长率，比采用测量值计算的更精确。特别是生物量浓度低时，如果测定生物量时使用了非常精密的仪器(如流动血细胞计数仪)，可使用初始生物量浓度的测量值进行计算。计算并评估试验过程中每天的(0dl d , l d2 d和2 d3 d)比生长率，并检查对照组的生长率是否符合质量保证与质量控制的要求。如果与总平均比生长率相比，第一天的比生长率相当低，说明第一天藻类处于生长停滞期。通过预培养消除对照组中的生长停滞期或使其最小化，暴露组中的生长停滞表明藻类经受试物作用后可能恢复或由于受试物的损
27、失(包括吸附于藻类暴露量减少了。因此，为了评价暴露期间发生的受试物对藻类生长的影响，应评价试验各阶段的生长率。如果平均比生长率和各阶段生长率间存在显著差异，说明藻类未保持持续指数增长，因此，要仔细检查生长曲线。b) 以比生长率为基础的抑制率，见式(2), 式中zI, =但二丘:!:X 100 c I , -以比生长率为基础的抑制率，%;( 2 ) 7 GB/T 21805-2008 c一一对照组各平行比生长率的平均值;T一一处理组各平行的比生长率。c) 生长量z试验期间，生物量的增长，见式(3): (YC-YT) Iy=一一飞7一-一X100 c 式中sL 以生长量为基础的抑制率，%;Yc-对
28、照组各平行生长量的平均值zYT处理组各平行的生长量，如果试验设置了洛剂对照组，进行抑制率计算时，应以溶剂对照组为准。( 3 ) 由比生长率和生长量分别得出的毒性数据没有可比性，在应用试验结果时应注意区分。由于计算方法的不同，由平均比生长率得出的EC.(即E，C.)一般高于由生长量得出的EC.(即EyC.)。由于仅仅是所使用的计算方法不同，两个变量灵敏度的差异不用特别说明。平均比生长率的定义基于在营养充足的条件下藻类的指数生长模式，毒性评价是依据受试物对生长率的影响，而不是依据对照组比生长率的绝对水平、剂量-效应曲线的斜率或试验周期。相对而言，基于生长量得出的结果是根据所有这些其他变量得出的.由
29、于种类和品系的不同，基于各试验中藻种的平均比生长率和最大比生长率得出的EyC.也不同。该响应变量不能用于比较不同种类和品系的藻类对有毒物质的灵敏度。用平均比生长率进行毒性评价更科学.9. 1. 3 绘制剂量-效应曲线以受试物浓度的对数值为横坐标，比生长率的抑制率或生长量的抑制率为纵坐标F作回归曲线，即为剂量-效应曲线，作回归曲线时应忽略上一阶段已定为异常值的数据。采用直线内插法或其他计算机统计软件得出EC、ECIO和(或)EG，。这些关键值.但该方法有时可能不适用2a) 计算机统计软件不适用于所得数据，专家评审更有利于得到更可靠的结果，这种情况下，一些软件甚至不能给出一个可靠的解决办法(叠代不
30、集中等。b) 一般的计算机统计软件不适于处理剌激效应的数据。9. 1. 4 统计分析通过回归分析得出量化的剂量-效应关系。对数据进行线性转化后例如概率单位、对数或韦布尔(Weibull)单位町，可能可以用加权线性回归进行统计，但是非线性回归是能够更好地处理不规则和偏离曲线但又不能忽略不计的数据的首选方法。对于像接近0%抑制率或100%抑制率这样不规则的难以进行分析的数据，通过转化可能被放大。注意使用概率单位、对数或韦布尔(Weibull)单位转化的标准方法是针对量子(如死亡率或存活率数据的，为了使其与生长和生物量的数据相兼容，必须进行改良。由连续数据确定EC.的特殊程序见参考文献町、10J和l
31、1J。附录C详细说明了非线性回归分析的应用。统计分析各响应变量，通过剂量-效应关系求出EC.及其95%置信区间如果可能。最好作图或统计分析响应数据是否与回归模型相符。采用各平行所得数据而不是各平行的平均值进行回归分析。如果数据过于分散，难以或不能采用非线性曲线，需用各平行的平均值进行回归，这样可以减少来自可疑异常值的影响。如果选择这样处理，在报告中应将其作为对常规程序的背离进行说明和验证，因为曲线与个别平行相符并不是个好结果。如果所得数据无法通过可以利用的回归模型/方法求出EC刊及其95%置信区间，可采用直线内插法。通过单因素方差分析(ANOVA)，比较各处理组受试物对藻类生长影响的平均值，得
32、出LOEC和NOECo必须采用适当的多重比较方法，比较各处理组的平均值和对照组的平均值是否存在显著性差GB/T 21805-2008 异。建议采用邓恩特(Dunnett)法或威廉(Williams)法进行多重比较，见参考文献12J、14J、15J、16J、17J。必须评估ANOVA中变量具有齐次性的假设是否成立。可通过作图或试验17进行评估。建议采用列文(Levene)法或巴特利特(Bartlett)法检验变量是否具有齐次性，如果结果是否定的，则应通过对数转换进行校正。如呆非齐次性异常显著，难以通过数据转换来较正，建议采用递减的Jonkheere趋势检验进行分析。其他确定NOEC的准则见参考文
33、献口口。近来科学的发展力主抛弃NOEC的概念而用EC，替代，对于藻类试验而言，X表示多少最合适尚未定论。10%20%范围内的值都比较合适(根据响应变量的不同)，最好能同时给出EClO和EC，o。9. 1.5 生长剌激试验有可能观察到低浓度生长剌激效应(负抑制率)0产生此效应的原因可能是毒物兴奋效应(毒物剌激效应或受试物中剌激生长的因子加入至最少量的培养基中所致。注意，加入无机营养盐并不会产生直接的影响，因为试验期间培养基中的营养成分是保持过剩状态的。计算EC时，如果观察到明显的剌激效应或需要求解的EC，中z值较低，建议采用毒物兴奋效应模型。否则可忽略不计。计算时尽可能避免从原始数据中删除剌激效
34、应的部分。如果所使用的统计软件不容许剌激效应(次要地位的出现，则采用直线内插法回9. 1.6 非受试物毒性引起的藻类生长抑制由于遮挡会减少有效光照，对于具有光吸收性的受试物来说，生长抑制现象加剧。应通过修改试验条件和试验方法等来区分由于理化性质等造成的对藻类生长的影响回相关准则见参考文献2J和3J。9.2 试验报告试验报告应包括以下内容=心受试物物理属性和相关理化性质，包括水中溶解度;一一化学特性如CAS编号)，包括纯度。b) 受试生物藻类的种类、来源或提供者，以及培养条件。c) 试验条件一一试验开始日期和持续时间;一一试验设计z试验容器、培养体积和试验开始时的生物量密度;培养基的成分;一一试
35、验浓度和平行(如平行数、试验浓度数及其公比); 一一试验溶液的配制，包括溶剂的使用;一一培养设备;一一光照强度和光质(来源，是否均匀); 温度，浓度测定=设定浓度和所有实测浓度，应说明添加回收试验的方法和仪器的最低检测限;对本标准的所有背离;生物量的测定方法，以及所测参数和干重的关系.d) 结果一一试验开始和结束时各处理组的pH值3一一生物量的测定方法，以及各测定点时各试验容器中的生物量，一-生长曲线生物量-时间); 一一计算出的各平行的各参数值，及其平均值和变异系数gF一-剂量-效应曲线;评估受试物对藻类的毒性，如EC、EC10、E乌及其置信区间。LOEC和NOEC及其统计GB/T 2180
36、5-2008 10 方法(可选); 如果采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计，说明最小显著差数，各处理组中任何对藻类生长有剌激效应的结果;一一观察到的其他效应，如藻类在形态学上的改变;一一结果讨论，包括对偏离的解释说明。附录A(资料性附录试验藻种A.l 生物品系A. 1. 1 绿藻羊角月芽藻CPseudokichneriellasubcaitata); 栅藻(Desmodesmussubsicatus)。A.1.2硅藻舟形藻CNaviculapelliculosa)。A. 1. 3蓝藻水华鱼腥藻CAnabaenaflos-aquae) ; 聚球藻CSynechococcusleopolie
37、nsis)。A.2 外观和特征(见表A.l)表A.l试验藻科的外观和特征项目P. subca pitata D. subspicatus N. pelliculosa 外观新月形或链形，椭圆形，杆状细胞单个细胞单个细胞大小(宽长)/mXm)(2-3) X (8-14) (3-12) X (7 -15) 3.7X7.1 细胞体积/(m/40-60 60-80墨40-50 个细胞干重/(mg/(2-3) X10- 个(3-4) X10- (3-4) X10- 生长率，/d-1 1. 5-1. 7 1. 2-1. 5 1. 4 a用电子颗粒计数仪测定的结呆.b用细胞大小计算的结果.c培养条件为OEC
38、D藻类培养基，光照强度70E.m-2 5-1，温度21C A.3 试验藻种的培养与测定GB/T 21805-2008 A. floaq阳eS. leo poliensis 椭圆形，杆状细胞链状细胞3X4.5 1X6 30-40 2.5b (l-2)X10 (2-3) X lO- 1. 1-1. 4 2.0-2.4 A.3.1 羊角月芽藻CPseudokirchneriellasubcapitata)和栅藻CDesmodesmussubspicatus) 多种培养基适用于这两种绿藻。合适的培养基类型可由提供单位获取。单个细胞，细胞密度的测定比较简单，可用电子颗粒计数仪或显微镜。A.3.2 水华鱼
39、腥藻CAnabaenaflos-aquae) 多种培养基适用于此藻。注意，必须在藻类进入生长停滞期前转接，否则将难以恢复。水华鱼腥藻CAnabaenaflos-aquae)会生长成链状细胞的集合体。根据培养条件的不同，形成的集合体大小形状也不同。进行显微镜下细胞计数或电子颗粒计数仪计数时必须破坏该集合体。为了减小计数差异，取样并进行超声波处理以破坏细胞的链状结构E经超声波处理后，链状细胞链长变短，但是超声时间过长会破坏细胞。各处理组超声的强度和时间应相同。11 GB/T 21805-2008 计数足够的视野数(血球计数板，至少400个小格有利于补偿计数差异。这可以改善显微镜下测定密度的可靠性。
40、可以使用电子颗粒计数仪测定经超声断链处理的总细胞体积。将藻种接种至试验容器中时，采用搅拌或其他类似方法使接种物悬痒。持续振荡(150r/min)或定时剧烈摇动试验容器，以防鱼腥藻聚团，如果已形成团状物，在取样进行测定时应剧烈摇动，以破坏藻团并使藻细胞均匀分布。A.3.3 聚球藻(Synechococcusleopoliensis) 多种培养基适用于此藻。合适的培养基类型可由提供单位获取。单个杆状细胞。细胞非常小，用显微镜计数很复杂也很困难。使用电子颗粒计数仪时，粒径范围应调至1血。也可使用体外荧光计进行测定。A.3.4 舟形藻(Naviculapelliculosa) 多种培养基适用于此藻。合
41、适的培养基类型可由提供单位获取。注意培养基中硅酸盐的量。在某些生长条件下会形成团状物。该藻类细胞有时能够产生脂类，因此在液面可能积聚成膜。基于以上原因，为了获得具有代表性的样品，在取祥测定时需采用某些特殊的方法。例如使用激涡搅拌器剧烈搅动。12 B.1 OECD藻类培养基OECD藻类培养基同IS08692中营养盐储备液1，常量营养盐NH,Cl MgCl, 6日，0CaCl, . 2H,0 MgSO, . 7H,0 KH2PO( 储备液2储备液3H3BOa MnCl, .4日，0ZnCl, CoCl, 6H,0 CuCl, . 2H,0 Na2MoO, .2H20 储备液4，NaHCO，NaHC
42、O, Na2SiOa .9H20 将配制好的储备液经0.2和储备液4只能通过滤膜过滤灭菌。B.2 APP藻类培养基附录B(资料性附录)培养基APP藻类培养基同ASTM中所述培养基，配制方法见表B.2o表B.2APP藻类培养基营养盐称药量定容体积储备液1，常量营养盐NaNO, 12.750 g 500 mL MgCl, 6H, 0 6.082 g CaCl, 2H, 0 2.205 g 四月21805-2008最终定容体积1000 mL ，40C避光冷藏保存.储备液2取用体积最终定容体积1 mL 1000 mL 13 GB/T 21805-2008 表B.2(续营养盐称药量定容体积取用体积最终定
43、容体积储备液2，微量营养盐H, BO, 92.760 mg MnCl, .4H, 0 207.690 mg ZnCl, 1. 635 mg FeCl, 6H, 0 79.880 mg 500 mL 1 mL CoCl, .6H, 0 0.714 mg NazMoO, .2H20 3.630 mg CuCl, .2H, 0 0.006 mg Na，EDTA.2日，0150.0mg Na2 SeO .5H, 0 0.005 mgb 1000 mL 储备液3，MgSO，.7H, 0 500 mL 1 mL MgSO, .7H, 0 7.350 g 储备液4，K，HPO，500 mL 1 mL K,
44、HPO, 0.522 g 储备液5，NaHCO，500 mL 1 mL NaHCO, 7.500 g 储备液6，N电Si03 9日，0NazSiOa 9HzO a a只有硅藻试验需要，可直接加入(202.4mg)或制备储备液，只要保证最终浓度为20mg/L(以Si计即可zb只有硅藻的储备培养时需要.定容用水为去离子水或蒸馆水，使用0.1mol/L或1.0 mol/L的NaOH或HCl调节培养基的pH值至7.5土o.1。将配制好的培养基经0.22m滤膜使用电子颗粒计数仪进行细胞计数时)或0.45m滤膜(不使用电子颗粒计数仪进行细胞计数时)过滤灭菌，4C避光冷藏保存直至用于实验。B.3 OECD藻
45、类培养基和AAP藻类培养基中各成分的比较(见表B.3)表B.3OECD藻类培养基和AAP藻类培养基中备成分的比较成分OECD AAP mg/L mM mg/L mM NaHCO, 50.0 0.595 15.0 0.179 NaN03 25.5 0.300 NH, Cl 15.0 0.280 MgCl, .6H, 0 12.0 0.059 0 12.16 0.059 8 CaCl, .2H, 0 18.0 0.122 4.41 0.030 0 MgSO, .7H, O 15.0 0.060 9 14.6 0.059 2 K, HPO, 1. 044 0.005 99 KH, P04 1. 60
46、 0.009 19 F巳Cl， 6H, O 0.064 0 0.0日02370.160 0.0口0591Na, EDTA.2H, 0 0.100 0.000 269 0.300 。.000806 H, BO, 0.185 0.002 99 0.186 0.003 00 14 GB/T 21805-2008 表B.3(续成分 4H,O OECD 0.415 0.003口口0.001 50 0.007 00 0.000 01 AAP ZnCl, c。2. 6HzO NazMo04 .2HzO CuCl, .2H,O pH 0.000 006 30 0.000 028 9 0.000 000 06
47、0.001 43 0.007 26 0.000 012 0.000 000 07 EDTA的摩尔小化。在使用舟形藻使其浓度达到1.4同时使重金属离子的整合作用最25C时的pH值与.( B.l ) 式中=M-Q-u叫-h-h15 GB/T 21805-2008 附录C(资料性附录非线性回归数据的统计C.1 概述在藻类及其他微生物生长试验中，响应变量即生物量的生长是持续呈比例变化的。过程速率(如果采用生长率及其全积分(如果采用生物量)，二者都将引用非暴露条件下重复测定的平均值，非暴露条件相对于暴露条件显示了最大的响应值，在藻类试验中光照和温度是主要的影响因素。如果不考虑单个细胞，可以认为试验系统中
48、生物量是持续的。该系统中由于响应类型不同变量的分布仅与试验因素有关(被描述为错误的对数正态分布或正态分布。这与典型的生物测定响应值相反，生物测定响应值使用个体公差(典型的二项式分布量化数据，而个体公差量化数据经常被假定是主要导致变异性的因素。这里的空白值为零或背景值。在不复杂的情况下，规一化的或相关的响应值(吵，只是简单的从1(0%抑制下降到U0(100%抑制)。注意，所用的响应值都有一个误差相伴，且明显的负抑制率仅是随机误差计算的结果。C.2 回归分析C.2.1 模型回归分析的目的是能够用数学回归函数定量描述浓度响应曲线，这个数学函数是y=!(C)或更经常使用的F(刀，当Z=lgC时。而反过
49、来可以用C=广1(y)计算EC.;I:包括EC，EClO和EC及其他们的95%置信区间。已经证明一些简单的数学函数可以在藻类生长抑制试验中成功地描述浓度与响应值之间的关系。函数包括对数方程式，非对称韦布尔(Weibul)方程和正态分布的对数函数，所有的方程曲线均为渐进的S形曲线，C趋近于零或无穷大。连续阂值的函数模型(例如Kooijman模型，Kooijman等在1996年用于数量生长抑制)是最近提出的或作为渐进模型的替换模型。这个模型假设在低于一定阂值EC，十时，浓度不起作用。这时用外推法估测的浓度响应关系与用简单的连续函数在浓度轴上截取的值在起点上没有区别。注意可用最小二乘法分析(假设变量恒定或者权重法，如果变
