1、ICS 13.300;13.020.40 A 80 道菌中华人民共和国国家标准GB/T 21806-2008 化学晶鱼类幼体生长试验Chemicals-Fish, j uvenile growth test 2008-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2008-09-01实施发布GB/T 21806-2008 前言本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.215(2000年)鱼类幼体生长试验)(英文版)。本标准做了下列编辑性修改z推荐鱼种增加了稀有鲍饵(Gobiocyprisrarus)和剑尾鱼(Xiphophorusheller
2、i)，并增加了相应的试验条件;将术语和定义从原文的附录调整为正文内容。本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位:环境保护部化学品登记中心。本标准参加起草单位z上海市环境科学研究院、环境保护部南京环境科学研究所、沈阳化工研究院安全评价中心。本标准主要起草人:卢玲、沈英娃、周红、梁丹涛、胡双庆、韩志华、陈光。I GB/T 21806-2008 化学晶鱼类幼体生长试验1 范围本标准规定了化学品鱼类幼体生长试验的方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本标准适用于评价化学物质对幼鱼生
3、长的延长暴露影响。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 最低可观察效应浓度lowest observed effect cooceotration, LOEC 与对照相比，对试验生物产生显著(0.05)效应的最低受试物浓度。2.2 无可观察效应浓度00 observed effect conceotratioo , NOEC 试验中直接低于LOEC的受试物设置浓度。2.3 效应浓度EC . 与对照组相比较，引起受试鱼生长率变化x%的受试物浓度。2.4 负荷率loadiog rate 每升水中鱼的鲜重。-m目吨嗷Auut M鱼的度中密水养升饲每FhJV 句2.6 单尾鱼比生长率in
4、dividual fish specific growth rate 根据单尾鱼的初始重量得出的生长率。2. 7 容器平均比生长率tank-average specific growth rate 某浓度下某个容器中鱼的平均生长率。2.8 假定比生长率pseudo specific growth rate 与整个容器中鱼的初始平均重量相比较而得出的单尾鱼平均生长率。3 受试物信息a) 结构式;b) 纯度sc) 水中溶解度zd) 燕气压ze) 水解离常数(pKa); 1 G/T 21806-2008 f) 正辛醇-水的分配系数CPow); g) 在水中和光中的稳定性zh) 在试验条件下的稳定性;
5、i) 同一受试鱼种的LC50值;j) 快速生物降解性试验结果;k) 在试验液中受试生物的可靠定量分析方法及其精确度、检测限。4 方法概述4. 1 原理处于指数生长阶段的幼鱼，在受试物的亚致死浓度范围内暴露于流水式试验条件或半静态试验条件。试验周期为28d。每天投饵，投饵量根据鱼的初始重量计算，14d后重新计算投饵量。试验前后称重鱼。通过回归模型来估算引起百分之z生长率变化的浓度，并分析对其生长率的影响。通过与对照组的比较确定最低可观察效应浓度CLOEC)，以及无可观察效应浓度CNOEC)。4.2 参比物无推荐的参比物。5 仪器设备实验室常规仪器设备;溶解氧和pH测定仪;测定水硬度、碱度的设备z
6、温度控制及连续测温设备;适宜的精密天平(至少精确到:l:0.5%);用化学惰性材料制成的试验容器，其容积应适于推荐的负荷和饲养密度(见附录A)。6 试验准备6. 1 系统选择试验期间，应尽可能维持条件恒定，使用流水式试验系统或半静态试验系统。6.2 试验鱼类6.2. 1 试验鱼类的选择推荐使用的淡水鱼种为稀有鲍挪CGobiocyprisrarus)、斑马鱼CBrachydaniorerio)和剑尾鱼CXiphophorus helleri)，见附录Ao如果使用其他鱼种，试验过程需调整相应的试验条件，并在报告中说明试验鱼种和试验方法选择的理由。6.2.2 试验鱼的驯养试验鱼应来自单一种群，并来自
7、同一批卵或幼鱼。试验前应在与试验相同的条件下驯养14d以上。事11养及试验期间，每天投饵量应为体重的2%4%。2 驯养开始48h后，记录死亡率，并按下列标准处理z一一驯养7d内，死亡率大于10%，舍弃全组鱼E一一死亡率在5%10%之间，继续驯养7d;在继续驯养的7d内死亡率超过5%，舍弃全组鱼g一一驯养7d内，死亡率小于5%，接受该组鱼试验。试验开始前的两周内及试验期间不对鱼进行任何疾病处理。GB/T 21806-2008 6.3 试验用水6.3. 1 水质试验用水的pH值应为6.58. 5，在试验期间变化幅度应保持在:f:O. 5的范围之内。推荐硬度(CaC03)大于140mg/Lo定期取样
8、进行分析，分析测定重金属(如Cu，Pb，Zn，Hg，Cd，Ni)，主要的阴、阳离子(如Ca，Mg，Na，K，Cl，S04)，农药(如总有机磷和总有机氯农药)，总有机碳和悬浮物。合格稀释水的要求参见附录B。试验期间水质应恒定。6.3.2 试验溶渍通过稀释贮备液的方法来配制所确定浓度的试液。贮备液的配制推荐采用机械方式(例如搅拌或超声)使受试物在稀释水中进行简单的混合或搅动。需要使用助溶剂或分散剂时，助溶剂对照组不能对幼鱼生长有明显影响，也不能对幼鱼有任何可观察的不利影响。推荐的助溶剂z丙酣、乙醇、甲醇、二甲基亚矶、二甲基替甲眈腊、三甘醇。推荐的分散剂z聚氧乙烯化脂肪酸甘油醋、吐温80、0.01%
9、的纤维素甲醋、聚氧乙烯化氢化M麻油。流水式试验应具备连续分配和稀释受试物贮备液的系统。每天定时检查贮备液和稀释水的流速，变化应小于或等于10%。半静态试验中，试液的更新频率取决于受试物的稳定性。浓度不稳定的受试物，采用流水式试验。7 试验程序7. 1 设计7. 1. 1 回归分析设计试验设计原则zu 试验设计的浓度应包含效应浓度。应设计预备试验Fb) 试验包括1个空白对照组及5个浓度梯度试验组。试验中使用助溶剂时，需增设助溶剂对照组zc) 采用几何级数系列或对数系列(见附录C)设置试验浓度，推荐对数间隔;d) 试验容器超过6个时，超出的部分容器可设置为平行，或用于增加梯度浓度ze) 回归分析优
10、于方差分析。没有合适的回归模型材0.9)时，使用NOEC或LOECo7. 1. 2 万差分析估计NOEC/LOEC值的设计每个浓度设置平行，对试验组进行统计分析。没有平行组时，对处于相同条件下的各试验鱼进行统计分析。设置5个浓度组，以几何级数分布，浓度间隔系数小于或等于3.20平行对照组的容器数量及试验鱼的数量应为每个试验浓度组数量的两倍。不设置平行时，对照组鱼的数量应与每个试验浓度组数量相同。根据容器数量进行方差分析(ANOVA)，需要足够的平行组，标准差自由度应大于或等于507.2 准备条件7.2. 1 试验鱼的选择和称量试验前取样称量，保持试验鱼的重量差异小。推荐试验用鱼的大小范围见附录
11、Ao试验用鱼的个体重量应在平均体重的士10%内，任何情况下都不得超过25%。试验前取部分鱼样品称量以测定平均体重。试验前24h停止喂食，随机挑选试验鱼。常规麻醉剂麻醉，逐尾称鲜重至相应精度(附录A)。合适重量的鱼随机分配到每个试验容器。记录容器中鱼的总鲜重。对幼鱼的处理应尽量小心以避免对试验动物的协迫与损伤。3 GB/T 21806-2008 试验28d后对鱼再次称重。需要重新计算饵料投喂量时，在试验14d进行称重。7.2.2 暴露条件试验持续时间:大于或等于28d o 负荷率与饲养密度应与试验所使用的鱼种(见附录A)相适应。在任何情况下，负荷率应保持溶解氧浓度不小于60%空气饱和值。试验期间
12、推荐的水质更新频率为6L/(g d)。投喂适量饵料(见附录A)。称重前24h内不投喂。每天喂食的量可分为同等的两份，并分次投喂。每天用吸管清除容器底部的饵料残渣和排泄物。光照周期与水温应适合试验鱼种(见附录A)。7.2.3 试验浓度设置5个受试物浓度。试验浓度低于5个应说明理由。设置的最高浓度不得超过受试物的水中溶解度。若使用助溶剂，其最终浓度应小于或等于0.1mL/L。尽量避免使用该类物质。稀释水对照组的数量依据试验设计而定。使用助溶剂时，助溶剂对照组的数量应与稀释水对照组相同。7.3 试验操作7.3. 1 分析测试试验期间定期测试受试物浓度。流水式试验时，每天检测稀释水与受试物贮备液的流速
13、，流速变动小于或等于10%。受试物浓度在配制浓度的土20%内，在试验开始时及其后每周1次，测定最高及最低浓度组的浓度。受试物浓度超出配制浓度的士20%，应分析所有试验浓度组的水样，分析测试频率同上。半静态试验时，受试物浓度在设定值的土20%内，在试验开始时及其后每周1次，分析测定新配制的试液和原试液，样品取自最高及最低浓度组。试验期闰受试物浓度超出配制浓度的士20%，应分析测定所有试验浓度，测试频率同上。试验结果应以测定浓度为准。试验期间受试物浓度保持在配制浓度的士20%内，结果可采用配制浓度。用0.45m孔径的滤膜对水样进行过滤或离心，推荐离心。试验期间应测定所有试验容器中的溶解氧、pH值和
14、水温。测定对照组和1个最高浓度组中的总硬度、碱度、盐度。半静态试验，每次试液更新前后应测试溶解氧和pH值。流水式试验至少每周测试1次pH值。每个试验应测定硬度和碱度。在1个试验容器中连续监测水温。7.3.2 观察试验结束时，对所有存活的鱼按试验容器称总鲜重或逐尾称鲜重。推荐称量总重。试验期间每天观察记录所有外部异常现象和反常行为。记录所有死亡率，尽快移除死鱼。不替换死鱼，负荷率和饲养密度应符合试验鱼的需求，以避免因试验容器中鱼数变化对试验鱼的生长造成影响，投喂量需相应调整。8 质量保证与质量控制4 a) 试验结束时对照组鱼的死亡率小于或等于10%;b) 对照组鱼的平均重量的增长，应大于或等于5
15、0%初始平均重量zc) 试验期间溶解氧浓度大于或等于60%空气饱和值sd) 试验期间各试验容器间的水温差小于或等于土1C，并应保持在受试生物适宜温度的士2C范围内(见附录A)。G/T 21806-2008 9 数据与报告9. 1 数据处理9. 1. 1 统计参数对死亡率超过10%的容器不计算生长率。说明所有试验浓度的死亡率。介于时间tj和t2间的比生长率r的计算方法见式(1)、式(2)和式。): 式中zlog.W2一log.W1二.j X 100 t2 - tj 10L有2-10豆有一r2-tz-t1 100 log.W2一og.Wjs=ue!_ X 100 t2 - tj Tj 单尾鱼的比生
16、长率，单位为每天(d-j); T2一一每个容器的鱼的平均比生长率，单位为每天(d-j); n一一假定比生长率，单位为每天(d-j); W j , W2一一某尾鱼分别在时间tj与t2时的重量，单位为克(g); log.Wj 试验开始期间单尾鱼的体重对数;log.W2-一一试验结束期间单尾鱼的体重对数zlog.Wj 试验开始期间容器中鱼重Wj的对数平均值EE豆有;试验结束期间容器中鱼重W2的对数平均值;t j , t2一一试验开始与试验结束的间隔时间，单位为天(d)。. ( 1 ) ( 2 ) . ( 3 ) Tj , 72 T3根据od28 d计算，理想的结果按od14 d和14d28 d计算(
17、例如在试验进行14d 时测量9. 1.2 统计分析方法9. 1.2. 1 结果的回归分析(浓度反应模型)符合比生长率与浓度之间的数学关系，用于估算ECXD根据r的容器平均值(T2)进行分析，适用于个体较小鱼种。绘制容器平均比生长率(T2)与浓度的关系图。选择恰当的模型，有适当的理论支持。当容器中存活的鱼数量不等，建立模型时应称重。拟舍模型图应显示与数据的关系。9. 1.2.2 LOEC的估计结果分析试验中每个浓度组都有平行，LOEC根据容器平均比生长率的方差分析(ANOVA)估算。存在显著性差异以p=0.05为界限)时，采用邓恩特(Dunnett)或威廉(William)检验，将每个浓度组的r
18、平均值与对照组的r平均值比较，确定最低浓度。当参数法不能满足正态分布(例如萨皮罗-威尔克ShapiroWilk检验或非齐次性差异(巴特利特Bartlett检验时，在方差分析前将数据转换为齐次性差异，或进行加权方差分析。试验中每个浓度没有平行，根据由单尾鱼得出的假定比生长率来进行方差分析。将每个试验浓度组的平均值与对照组的平均值进行比较，确定LOEC。9.2 试验报告试验报告应包括z试验名称、目的、试验原理、试验的准确起止日期以及下列内容z5 GB/T 21806-2008 6 a) 受试物一一物理属性和相关理化特性;一一化学标识数据，包括受试物纯度、所用的定量分析方法等。b) 供试鱼种学名、品
19、系、个体大小、来源以及所有的前处理等。c) 试验条件试验程序z一一试验设计;一一贮备液的配制方法与试液更新频率;如使用助溶剂，应给出其化学名和浓度;一一试验的设置浓度、实测浓度及其标准差，以及分析测量方法等;一一稀释水特性:pH值、硬度、碱度、温度、溶解氧浓度、残留氯水平(如测定)，总有机碳、悬浮物、盐度(如测定)以及其他所做的测定:一一-试验容器中水质，pH、硬度，温度和溶解氧浓度;一一饵料的详细信息。d) 试验结果一一对照组总存活率，是否符合该鱼种的有关标准，符合有效存活标准的证据，以及所有试验浓度组中的死亡率数据;一一所用的统计分析技术，依据平行或鱼进行统计，数据处理与所用技术的理由;一
20、一列表数据包括:在od、14d以及28d时的个体重或平均鱼重，或者od-28 d期间或o d-14 d和14d-28 d期间的容器平均鱼重或假定的比生长率。统计分析结果，以表格和图形表示，包括标准差，以及LOEC(=0.05)和NOEC或EC.%O一一所有鱼的异常反应发生率，以及由受试物引起的各种可观察效应。e) 结果讨论结果讨论，对偏离测试准则之处加以说明。如果试验溶液中的受试物实测浓度在数量级上接近分析方法的检测限，或半静态试验中，新配制的试液与更新前的试液之间出现受试物浓度下降时，应慎重解释结果。GB/T 21806-2008 附录A(资料性附录)试验鱼种及适宣的试验条件A.l 试验鱼种
21、及适宜的试验条件见表A.lo表A.1试验鱼种及适宜的试验条件推荐的试光周期/推荐的初负荷率/饲养密度/试验周期/鱼种验温度始鱼重测量精度饵料h Cg/L) (尾/L)d 范围/C范围/g活饵料斑马鱼2125 1216 O. 0500. 100 1 mg O. 21. 0 510 CBrachionus 二主28Bachydaio rerio Artemia) 活饵料稀有钩侧2125 1216 O. 0500. 100 1 mg o. 21. 0 510 CBrachious 二28Gobiocypris rarus Artemia) 剑尾鱼活饵料2125 1216 O. 52. 5 50 mg
22、 1. 22. 0 4 CBrachionus 二三28Xihophorus helleri Artemia) 虹鲸鱼。lcorhvnchus 12. 516.。1216 15 mykiss 干的蛙鱼100 mg 1. 22. 0 4 二28左右鱼苗食品青鳝活饵料2125 1216 O. 0500. 100 1 mg O. 21. 0 520 CBrachionus 二主28Oryzias latipes 左右Artemia) 7 GB/T 21806-2008 附录B(资料性附录)合格稀释水的化学特性B.1 合格稀释水的化学特性见表B.lo表B.1合格稀释水的化学特性物质浓度颗粒物20 mg
23、/L 总有机碳2 mg/L 游离氨1g/L 残留氯10闯/L总有机磷农药50 ng/L 总有机氯农药与多氯联苯(PCB)50 ng/L 总有机氯25 ng/L 8 GB/T 21806-2008 附录C(资料性附录毒性试验的浓度对数系列C.1 毒性试验的浓度对数系列见表C.1.表C.1毒性试验的浓度对鼓系列1J栏(在100和10之间，或在10和1之间的浓度数目沪1 2 3 4 5 6 7 100 100 100 100 100 100 100 32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 3.2 10 18 25 32 37 42 1. 0 4.6 10
24、16 22 27 32 2.2 5.6 10 15 19 24 1. 0 3.2 6.3 10 14 18 1. 8 4.0 6.8 10 13 1. 0 2.5 4.6 7.2 10 1. 6 3.2 5.2 7.5 1. 0 2.2 3.7 5.6 1. 5 2.7 4.2 1. 0 1. 9 3.2 1. 4 2.4 1. 0 1. 8 1. 3 1. 0 a 5个(或更多)连续系列浓度可从一个栏中选择。栏(x)的中点浓度亦存在于栏(2x+D中。表中所列数值以(rng/L或g/L)表示，亦可将数值乘以或除以10.如果不能确定毒性水平，可考虑使用栏1的数值。C.2 参考文献lJ Envir
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