1、1CS 13300：1302040A 80 固雪中华人民共和国国家标准GBT 2181512008化学品200805-12发布海水中的生物降解性摇瓶法试验Chemicals-Biodegradability in seawater-Shake flask method2008090 1实施宰瞀髁鬻瓣警雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会促卫1前言1范围2术语和定义3受试物信息4方法概述-5试验准备6试验程序7质量保证与质量控制8数据与报告附录A(资料性附录)附录B(资料性附录)附录C(资料性附录)参考文献-目 次海水中有机碳的测定方法数据记录表海水中的生物降解性GBT 2181512008111
2、1234467O2刖 吾GBT 2181512008GBT 21815-2008化学品海水中的生物降解性预计分为两部分：第1部分为化学品海水中的生物降解性摇瓶法试验；第2部分为化学品海水中的生物降解性密闭瓶法试验。本部分为GBT 21815的第1部分，本部分等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No306(1992年)海水中的生物降解性：摇瓶法(英文版)。本标准做了下列编辑性修改：将引言、应用、方法选择归为附录C；将计量单位改为我国法定计量单位。附录A、附录B和附录C为资料性附录。本部分由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SACTC 251)提出并归口。本部分负责起草单位：环境
3、保护部化学品登记中心。本部分参加起草单位：环境保护部南京环境科学研究所、沈阳化工研究院安全评价中心、上海市检测中心。本部分主要起草人：周红、营小东、刘纯新、刘济宁、石利利、贾福艳、赵华清。化学品 海水中的生物降解性摇瓶法试验GBT 21815卜一20081范围GBT 21815的本部分规定了化学品海水中的生物降解性摇瓶法试验的方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本部分适用于测试与评价可溶于水(水中溶解度以C计大于25 mgL，)、试验过程中不因挥发性而有明显损失、无明显吸附作用的有机物的海水中的生物降解性。本部分不适用于水中溶解度以C计小于5 mgL的有机物。2术语和
4、定义下列术语和定义适用于GBT 21815的本部分。21生物降解性biodegradability受试物与接种物接触表现出的生物降解潜力。22溶解性有机碳dissolved organic carbon；DOC溶液中有机碳的含量，常指通过045 pm滤膜过滤后液体中的有机碳含量，或经4 000 rmin转速离心15 min后上清液中的有机碳含量。23停滞期lag phase试验开始到降解率达到10的时期。3受试物信息a)分子式；b)纯度；c)主要成分及比例id)有机碳含量；e)水中溶解度；f)蒸气压；g)吸附性；h)微生物毒性。4方法概述41方法说明摇瓶法是一个引进海水变量的改进的OECD筛选
5、试验嘲。其试验结果并不指示有机物的快速生物降解性，只是为了获取其在海洋环境中的生物降解性的信息。试验结果降解性低，并不一定意味受试物在海洋环境中不可生物降解，而是说明需要更多的工作来说明其降解性。试验方法的说明见附录C。GBT 218151200842方法原理培养基中加入适量的受试物(质量浓度为5 mgL40 mgL，以DOC计)与采自海水的接种物，若DOC分析灵敏度较高，或受试物具有抑制作用时，可适当降低受试物浓度。在温度为1520C(土2)、黑暗或散射光及有氧条件下搅动培养，定期采样测定DOC浓度以确定降解率。为了实验的客观性，若要模拟周围环境情况，试验可以在超出推荐范围的温度下进行。推荐
6、的试验持续时间最大为60 d。在某些情况下，可通过特定的化学分析方法测定受试物浓度，以确定初级降解性。43参比物本标准推荐苯胺(新蒸馏)、醋酸钠或苯甲酸钠作为参比物。若使用其他参比物，试验报告中应加以说明。比对实验中，海水样品取自于不同地点、每年的不同时间o。对于苯甲酸钠，停滞期(屯)和从停滞期到降解率达到50的时间(so)分别是1 d4 d和1 d7 d。对于苯胺，t。范围是0 d10 d，t。范围是1 d10 d。44方法重现性和灵敏度说明比对试验说明了本标准的重现性03。若用有机碳分析仪，本标准适用的受试物的最低浓度，主要取决于有机碳分析仪的检测限(约为05 mgL)和海水中DOC浓度(
7、开放海域的海水通常为3 mgL5 mgL)。加入受试物后，背景DOC浓度不应大于总DOC浓度的20。否则，试验前可通过不时老化海水的方法来减少背景DOC浓度。若只用特定的化学分析方法(该方法用于测定初级降解性)，研究者应提供附加信息说明受试物是否可能发生最终降解，附加信息可以包括快速生物降解性或固有生物降解性的实验结果。5试验准备51仪器设备a)振荡器(自动恒温控制或置于恒温室内，15。C20，2)；b)锥形瓶(O5 L2 L)；c)膜过滤器或离心机；d)滤膜(O2 pmO45 pm)；e)碳分析仪；f)特定化学分析仪器(可选)。52海水521海水的采集选择合适的取样地点，调查海水污染状况及营
8、养物浓度，尤其对于沿海水域样品，应确定异养微生物菌落数、硝酸盐、铵盐和磷酸盐的浓度。海水样品须在试验前1 d2 d内采集，且在不明显高于试验条件的温度下运输和保存。记录下列关于海水样品的信息：a)采集时间；b)采集深度；c)表观(如：浊度，等)；d)采集温度；e)盐度；f)DOC；g)试验前样品保存天数。2oBx 2181512008522海水的老化和预处理当海水样品中有机碳浓度高于受试物培养液DOC浓度的20时，海水须进行老化。在试验温度、黑暗或散射光与有氧条件下(必要时轻轻搅拌)，老化约一周，以去除过多的DOC。试验前预处理去除样品中的颗粒物，通过尼龙过滤器或粗滤纸过滤去除(不是通过膜过滤
9、或GF-C过滤器)，或通过沉淀、倒出上清液的方式。预处理在老化后进行。记录老化和预处理情况。53接种物试验中不能加入特定接种物，只含海水中包含的微生物。对于近海或污染海域的海水样品，应通过平板计数法确定海水样品中异养微生物的菌落数，并采用参比物检验海水中异养微生物的活性。54培养基541培养基贮备液用分析纯试剂配制下列贮备液：a)磷酸缓冲液：称取850 g磷酸二氢钾(KH。PO,)、2175 g磷酸氢二钾(K2HPO。)、3330 g二水合磷酸氢二钠(NazHPO。2H：O)和050 g氯化铵(NH。C1)，用蒸馏水溶解，定容至l L；b)氯化钙溶液：称取2750 g无水氯化钙(CaCl：)，
10、用蒸馏水溶解，定容至1 L；c)硫酸镁溶液：称取2250 g七水合硫酸镁(MgSO。7H。O)，用蒸馏水溶解，定容至1 L；d)氯化铁溶液：称取025 g六水合氯化铁(FeCI。6H：O)，用蒸馏水溶解，定容至1 L。每升氯化铁溶液中可加入005 mL浓盐酸或04 g EDTA二钠盐，以免出现沉淀。如果出现沉淀，应重新配制。542试验培养基的制备每升预处理海水中加入541中a)、b)、c)、d)贮备液各1 mL，混匀。6试验程序61组别设计通常，试验中需要设置下列组别：含受试物的试验组；仅含海水的空白对照组；含参比物的程序对照组。必要时，增加下列组别：含受试物和参比物的毒性对照组；含受试物和灭
11、菌剂的理化对照组。试验组与空白对照组分别为两个平行，其他处理组为1个平行。受试物浓度以DOC计，一般为5 mgL40 mgL，参比物的浓度以DOC计，为20 mgL。试验中加入的若为受试物或参比物的贮备液，应确保海水培养基中盐度无较大变化。若存在毒性作用影响却无法去除，增加毒性对照组。毒性对照组中参比物的浓度与程序对照组相同，以DOC计，为20 mgL。若存在非生物降解或者损耗机制，例如水解(该问题只存在于特定分析)、挥发或吸附，建议增加物化对照组。物化对照实验可以通过加入50 mgL100 mgL氯化汞(HgCI：)抑制微生物活性来达到。(HgCIz是剧毒物质，应当谨慎操作。该物质的废液需要
12、妥善处理，不可排人废水系统中。加入HgCl。，DOC分析中应考虑干扰作用或催化剂中毒。)62试验操作将适量的试验溶液加入锥形瓶中，溶液的体积以12锥形瓶容积为宜，盖上瓶口(不能盖紧)，确保瓶内外空气的交换(如，用铝箔纸。若进行DOC分析，棉花塞不适用)。3GBT 2181512008将锥形瓶放人振荡器中，调节转速(如，100 rrain)，控制温度(1520*(3，土2)，开始培养。试验周期最长60 d。试验要求在避光条件下进行，以防止藻类滋长。同时确保空气中没有有毒物质。63采样与DOC分析试验期间以合适的时间间隔至少采样5次，试验开始(0 d)和结束(60 d)时必须采样。采样量取决于分析
13、方法(对于特定化学分析而言)、碳分析仪和样品处理程序(膜过滤或离心)。在取样前确保受试物混合良好，瓶壁上的所有物质都呈溶解态或悬浮态。样品采集后，立即经膜过滤(o2 pmO45 pm滤膜)或离心(4 000 g、15 rain)处理。有些滤膜键合了一些含有表面活性剂的亲水性基团，可能会释放大量的有机碳。可将滤膜置于去离子水中煮沸处理，连续三次，每次1 h，将滤膜储存于去离子水中(在低浓度下，通过离心分离作用不大，在以C计大于10 mgL的较高浓度下，离心过滤法误差相对较小)。样品尽量于当天完成测定，每个样品平行测定两次。根据测定结果，确定下次采样时间。必要时，样品可在24下保存48 h或在一1
14、8长期保存(若已知受试物不会受到影响，则保存之前酸化至pH值为2)。若样品保存一段时间后再进行分析，在所需最少的5个样品基础上取更多样品。分析测定时可先分析最后采样样品，用逐步倒退法选择分析其他样品，便可以相对较少的分析次数获得较好的生物降解曲线。若在60 d之前观测到降解曲线稳定期，结束实验；如果在60 d之前开始出现明显的降解，但没有达到稳定期，应延长试验时问。海水中有机碳的测试见附录A。7质量保证与质量控制7，1参比物苯甲酸钠停滞期(九)为1 d4 d，停滞期末至降解率达50的时间(so)为1 d7 d；苯胺停滞期为0 d10 d，停滞期末至降解率达50的时间(f。)为1 d10 d。7
15、2空自对照组DOC浓度不大于受试物试验组的20。8数据与报告81数据处理将试验数据填写在数据记录表中，见附录B。计算受试物和参比物的百分降解率(D。)，见式(1)：D：一J 1一旦二生堕I100L “一Chl(0)J式中：D：f时DOC或受试物的降解率，以表示；含受试物试液的初始DOC或受试物质量浓度，单位为毫克每升(ragL)；Ct含受试物试液t时刻的DOC或受试物质量浓度，单位为毫克每升(ragL)；c。空白对照组的初始DOC或受试物质量浓度，单位为毫克每升(mgL)；“。，空白对照组f时刻的DOC或受试物质量浓度，单位为毫克每升(ragL)。DOC适用于计算受试物最终生物降解性，受试物质
16、量浓度适用于计算受试物初级生物降解性。DOC测评精确到o1 mgL。算出两组试验组的平均值。绘制生物降解曲线，若数据足够多，计算停滞期(屯)和停滞期末至降解率达50的时间(t；。)。82结果报告试验报告应包括以下内容：a)受试物4GBT 2181512008物质的物理属性，以及相关的基本理化性质；基本鉴定信息(如纯度、主要成分等)。b)试验条件海水取样点情况(地点、污染和营养状况，包括菌落数，硝酸盐、铵盐、磷酸盐浓度)；海水样品情况取样时间、深度、外观、温度、盐度、DOC浓度(可选)、保存时间；海水老化的方法(如有)；海水预处理方式(筛滤或沉淀)；D0c测定方法；受试物特定化学分析方法(可选)
17、；海水中异养微生物数量的测定方法(如，平板计数法等，可选)；海水特性的其他测试方法(如，ATP测试法等，可选)。c)结果分析测定数据，见附录B；降解曲线，标示停滞期(屯)、斜率、停滞期末至降解率达50的时间(。)等。降解曲线示意图见图1；60 d后或试验结束时的降解百分率。d)结果讨论。芝lOO甜盘书4 80604020o停滞期图1降解曲线示意图GBT 2181512008A1测试方法附录A(资料性附录)海水中有机碳的测定方法为了测定水样中的有机碳含量，一般采用以下3种方法把水样中的有机物氧化为二氧化碳：利用过硫酸盐一紫外照射，湿法氧化；利用过硫酸一加温(116130)，湿法氧化；燃烧法。生成
18、的二氧化碳利用红外分光光度法或者滴定法进行定量。或者将二氧化碳转化为甲烷，利用火焰离子化检测器测定。过硫酸盐一紫外法一般用于微粒含量低的“干净”水样的分析。后两种方法适用于大部分水样，过硫酸一加温氧化法更适用于低浓度样品，燃烧法则更适用于非挥发性有机碳浓度以C计高于1 mgL的水样。A2影响因素分析上述3种方法都是建立在消除或者修正样品中无机碳(c)的基础上。现在，常用的方法是对酸化的样品进行吹洗以去除二氧化碳，但这样会损失一部分可挥发性有机物。应确保每个样品都要进行无机碳的去除或者补偿，而且应根据样品类型，在测定非挥发性有机碳的基础上测定挥发性有机碳。高浓度氯化物的存在会降低过硫酸盐一紫外法
19、的氧化效率。通过使用加入硝酸汞改良的氧化剂可以消除这种影响。建议利用最大可允许量来评价每个含氯化物的样品。样品中如果含盐量较高的话，利用燃烧法会导致盐上附着一层催化剂，从而加快燃烧管的腐蚀。应根据生产商的操作说明书预防腐蚀的发生。浑浊的或者含微粒的样品在使用过硫酸盐一紫外氧化法时，会导致氧化不完全。A3 示例非挥发性有机碳的测定利用过硫酸盐一紫外照射进行湿法氧化，非发射红外光度法测定二氧化碳。氧化剂按照如下程序进行配制：a)82 g HgClz和96 g Hg(NOs)zHzO溶于低碳含量的水中；b)20 g KzSzOs溶于上述汞盐溶液中；c)上述b)溶液中加入5 mL硝酸；d)上述c)溶液
20、加溶剂定容到1 000 mL。海水中含10的氯化物时，使用40 pL氧化剂溶液；含19的氯化物时，使用200 pL氧化剂溶液，可以去除氯化物的影响。B1实验室名称B2试验起始时间B3受试物名称：贮备液质量浓度(mgL)：初始质量浓度(mgL，以受试物计)(mgL，以DOC计)：B4海水来源：采集时间：采集深度：采集时海水外观(浊度，等)：盐度(10-3)：温度()：采样后小时后DOC浓度(mgL)预处理(过滤、沉淀、老化等)附录B(资料性附录)数据记录表微生物数量海水采样时(菌落数mL)测试起始时(菌落数mL)其他特征：B5 DOC测定结果DOC测定结果见表B1。表B1 DOC测定结果GBT
21、2181512008nd后DOC瓶号 (ragL)0fnl试验组 1 Cl 2平均，01(1)7GBT 2181512008表B1(续)”d后IX)C瓶号 (mgL)0C121试验组 Z Cd 2平均，C“1)Cb11l Cbll2平均，“。)Cb21空白对照组2 “2平均，c比“)平均值bI70，ThOn理论需氧量60)，可以得出其在海洋环境具有潜在生物降解能力的结论。然而，阴性的试验结果并不排除受试物具有生物降解潜力，只是说明需要更多的研究，例如，采用尽可能低的受试物浓度。C22任何情况下，若需要了解某一特定场所海水中的生物降解的速率或降解度的确切情况，应采用其他更复杂、更综合、也更昂贵的
22、实验方法。例如，采用与环境中可能浓度相近的受试物浓度的仿真试验。同样，也可以采用取自需测试地点的未加强、未预处理的海水。其初级生物降解性可以通过特定化学分析方法测得，最终生物降解性需要14c标记化学品，这样就可以测出现实环境中溶解性有机14C消失和“CO。产生的速率。c3方法选择C31测试方法的选择基于多种因素，表C1有助于选择何种方法。当化学品的水中溶解度以C计低于5 mgL时，就不可用摇瓶法，至少，原则是如此，难溶性化学品可以通过密闭瓶法。10表c1 摇瓶法和密闭瓶法测试的优缺点GBT 218 T5卜一2008方 法 优 点 缺 点除碳分析外，要求的仪器简单； 需要进行碳分析；60 d的试
23、验周期不存舟题； 受试物以DOC计，5 mgL无硝化作用干扰； 40 mgL，可能对微生物产生抑制摇瓶法 可用于挥发性化学品 作用；当海水中DOc浓度低时，DOC的测定较困难(氯化物影响)；在海水中DOC有时较高仪器简单i 保持瓶子的气密性较难i终点测定简单； 瓶壁上细菌的快速增长可能会导受试物浓度低，减少了对微生物的 致错误的结果；密闭瓶法抵制作用； 空白Oz测定值会偏高，尤其在28 d易于适用于挥发性化学品 后。可以通过老化海水消除；硝化作用耗氧可能产生影响GBT 2181512008参考文献r1De Kreuk JFand Hanstveit AODetermination of the
24、 biodegradability of the organicfraction of chemical wastesChemospbere，(1981)10(6)：561-572r2 OECD Test guideline 301 EParis(1992)r3Nyholm Nand Kristensen PScreening test methods for assessment 0f biodegradability ofchemical substances in seawaterFinal report of the ring test programme 1984-1985，March 1987，Commission of the European Communities(1987)41 OECD Test guideline 209Paris(1984)r5 OECD Test guideline 301 DParis(1992)12
