1、ICS 65. 100 B 16 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 25864一2010球子包白僵菌粉剂Powder of Beauveria bassiana 2011-01-10发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2011-06-01实施发布前言本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。本标准由国家林业局提出并归口。GB/T 25864-2010 本标准起草单位:国家林业局森林病虫害防治总站、安徽农业大学、中国林业科学院、华中农业大学微生物农药国家工程研究中心。本标准主要起草人:郭志红、李增智、陈昌洁、宋玉双、喻子牛、樊美珍、胡加富、崔
2、永三、苏宏钧、李林、任浩章。I GB/T 25864一201051 球抱白僵菌粉剂是一种真菌杀虫剂。自僵菌经过发酵获得分生抱子，经萌发侵入目标害虫体内，破坏害虫组织并产生毒素，使害虫致死。球抱白僵菌的名称及基本参数如下:菌种中文通用名:球抱白僵菌。菌种拉丁文学名:Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. 分类地位:球抱自僵菌在分类上属于真菌门(Eumycota)，半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝抱纲(Hyphomycetes) ，丛梗抱目(Moniliales)，丛梗抱科(Moniliaceae)，白僵菌属(Beauveria)。鉴定特征:在麦芽浸膏培
3、养基上，菌落的菌丝呈白色绒状，后期呈丛卷毛状至粉状，背面初期无色，菌落产拖后呈淡黄色至粉红色。分生抱子梗常浓密簇生(但有时单生或轮生)，呈瓶状，形成之字状弯曲产抱轴。分生抱子球形，透明，薄壁。大小为(2m3m)X(2m2.5m)。E 菌种保藏条件:温度5.C;避光;封装。有效成分主要存在形式:分生抱子。生物活性:主要用于防治鳞翅目害虫。适宜生长条件:麦芽浸粉或PDA培养基、适宜温度25.C、pH6.最适贮存温度:5.C。球子包白僵菌粉剂1 范围本标准规定了球抱白僵菌粉剂的要求、检验方法及标签、包装、贮运等规则。本标准适用于球抱白僵菌经生物发酵与加工而获得的分生抱子粉剂。本标准不适用于布氏自僵菌
4、或其他种类白僵菌生产的杀虫剂。2 规范性引用文件GB/T 25864一2010下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 1605-2001 商品农药采样方法GB 3796-2006 农药包装通则GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 球砸自僵菌粉jfljBeauveria powder product
5、 由球抱白僵菌纯菌种经生物发酵生产与加工而获得的分生于包子粉剂。是防治多种害虫的真菌杀虫剂。3.2 球砸自僵菌Beauveria bassiana CBals.) Vuill. 一种半知菌类的虫生真菌，分类上属于真菌门CEumycota) ，半知菌亚门CDeuteromycotina)，丝抱纲CHyphomycetes) ，丛梗抱目CMoniliales)，丛梗抱科CMoniliaceae)，白僵菌属CBeauveria)。3.3 分生于包子conidia 一种元性繁殖细胞。着生于分生抱子梗上的瓶状产胞细胞顶端，对昆虫具有致病力。球抱白僵菌的分生抱子大部分呈球形。3.4 含子包量conidia
6、 content 每克白僵菌粉剂中所含的分生抱子数。3.5 于包子萌发率germination rate of conidia 白僵菌粉剂中所萌发的白僵菌抱子数占抱子总数的百分比。3.6 毒力测定bioassay 用杀虫剂感染目标害虫或指示昆虫使其感病死亡，是检验杀虫剂毒力的过程。1 GB/T 25864一20103. 7 毒力virulence 对目标害虫的致死能力，以通过活体生物测定得到的致死中时LTs。表示。3.8 干燥藏量loss in weight 样品在规定条件下，经加热干燥后质量减少的百分数，即样品中水分及少量低挥发物的量。3.9 杂菌率microbial contaminant
7、 真菌农药中除有效成分真菌外，其他影响有效成分真菌生长的菌占总菌量的百分比。4 要求4. 1 外观白色或浅灰白色粉末，不可以有团块。4.2 控制项目指标球抱白僵菌粉剂应符合表1的要求。表1球砸自僵菌粉剂控制项目指标含抱量抱子萌发率毒力LT50杂菌率干燥减量细度贮存稳定性5 检验方法5. 1 抽样项目指标高抱粉二三1000亿抱子/g低抱粉100(士10)亿袍子/g高于包粉):90.%低抱粉二90.%高抱粉LT50:(5d 低抱粉LT50:(6d 高于包粉王三5.%低抱粉:(10%高于包粉三10.%低抱粉笔三10%高于包粉全部通过160自筛低抱粉全部通过35目筛在5C条件下贮存180d，袍子萌发率
8、大于标明值的80%按照GB/T1605-2001中5.l. 3商品农药采样方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于100g。5.2 鉴别试验5.2. 1 菌种鉴别根据所提供的菌种形态学、生物化学、DNA分子特征或国际公认机构的鉴定特征，用显微镜观察法从生物形态上进行鉴定或采用其他(如生物化学、DNA片段序列)方法进行鉴定。5.2.2 菌种仲裁鉴定当对鉴别结果有怀疑或争议时，应到有菌种认证资质的单位，与菌种保藏中心保藏的生产菌株进行2 对照，由2名以上的专家确定后，出具菌种鉴定报告，作为仲裁依据。5.3 含抱量的测定5.3.1 方法提要GB/T 25864-2010 本试验采用显
9、微记数法。将精剂稀释至适当倍数，在显微镜下用血球记数板计抱子数，然后计算含抱量。5.3.2 试剂吐温80(化学纯)。5.3.3 仪器及设备光学显微镜、精度为千分之一的天平、组织捣碎机、血球记数板(16X 16)、微量移液器、玻璃器皿等。5.3.4 检验程序用精度为千分之一的天平准确称取低抱粉1.00g或高于包粉0.10g，装人组织捣碎机的盛液杯中，同时加入0.1mL的吐温80、200mL清水，以5000 r/min的速度搅拌2min，加清水定容至500mL, 再以5000 r/min的速度搅拌1min，使之成为均匀的抱子悬浮液。将抱子浓度控制在每中格2040个，如果不合适可以稀释样品调节成此浓
10、度。取深度为0.1mm、血球计数板格为16X16个中格，盖上配套专用盖玻片，用吸管吸取配制好的悬浮液沿盖玻片的边缘滴人，使抱子液恰好充满盖玻片于载玻片之间，以抱子液不人槽为度，多余抱子液用滤纸吸去。放在显微镜载物台上静置1min2 min，待浮动的抱子静止后，放大400倍检视计数。5.3.5 检验结果计算血球计数板记数格为16个中格，每个中格为16个小格，则计算双线范围内任一斜对角线上的四个中格共64个小格的抱子总数。记数时每中格的四周如有压线的抱子，计上线不计下线，计左线不计右线。按公式(1)计算待测样品的抱子含量:S (51 + 52 + 53 + 54) X 4 X 106 X T 一6
11、4 式中zS一一含抱量，亿抱子/g;5154 任意4个中格中抱子的数量;T一一一稀释倍数。每个样品设3个重复。允许误差率为10%。5.4 拍子萌发率的测定. ( 1 ) 将50mL麦芽浸粉培养液(麦芽浸粉2%，用蒸馆水配制)注入预先放入2030个直径5mm玻璃珠的250mL三角瓶中，在121.C条件下灭菌20min后，放人待测低抱粉0.2g(或根据含抱量换算成适合镜检的克数，高于包粉亦然)，置于120r/min的摇床上，在25c条件下培养8h16 h(视菌种特性而定)，取样制片镜检。用血球数板计数，芽管大于抱子半径的抱子计为萌发抱子。按公式(2)计算抱子萌发率z式中zR一一抱子萌发率，%;N一
12、一萌发抱子总数;M一一检查抱子总数。R=革X100% 每个样品设3个重复。允许误差率为10%。5.5 干燥威量的测定5.5.1 仪器及设备扁形称量瓶(50mm); .( 2 ) 3 GB/T 25864-2010 电热恒温干燥箱(士2.C)。5.5.2 测定步骤将扁形称量瓶在110C干燥箱烘15min，取出称量、记录。准确称取5.00g样品放入皿内，在(105 :J: 2).C电热恒温干燥箱中烘1h。取出后将样品和扁形称量瓶一起称重，减去扁形称量瓶的重量。按公式(3)计算干燥减重(含水率): w一-5. W . ( 3 ) 式中zW一一干燥减重，%;W1一一烘干后样品重量，g。每个样品设3个重
13、复。允许误差率为2%。5.6 毒力测定按附录A、附录B进行，5. 7 杂菌率测定(CFU法)5.7. 1 采用2%麦芽浸膏、2%营养琼脂配制培养基，121.C高压灭菌20min后凉至45c左右，倒入培养皿制成2mm4 mm的平板。5.7.2 按5.3.4中的操作步骤称样、均散、稀释(用元菌水)。稀释倍数依具体情况而定，或同时做几个稀释梯度，使每个培养皿中的菌落保持在1020个。5.7.3 用微量移液器接种100L菌液到培养基平板上，用曲玻棒涂布均匀。做10次重复。5.7.4 在27.C条件下培养48h，根据菌落特征分辨球抱白僵菌或杂菌，分别计数。计算出杂菌占总菌落数的百分比。5.8 细度的测定
14、按照GB/T16150-1995中的2.1干筛法(适用于粉剂)执行。高于包粉应全部通过160目筛，低抱粉应全部通过35目筛。5.9 贮存稳定性的测定将产品在5.C条件下贮存180d，抱子萌发率应大于标明值的80%。6 标志、标签、包装和贮运6. 1 标志、标签球抱白僵菌粉剂的标志及标签应符合GB3796-2006的规定。标签上应注明贮运条件。6.2 包装产品包装要求应符合GB3796一2006的相关规定。6.3 贮运6.3. 1 贮藏地点球抱白僵菌粉剂的贮藏应选择低于20.C、干燥、通风、蔽光的场所。有条件的应在5.C条件下保存。6.3.2 运输球抱白僵菌粉剂在运输中应密封防潮、防晒、防高温、
15、防雨淋。避免与皮肤、眼睛接触，防止由口鼻吸人。6.4 产品特殊要求产品应采用塑料袋密封包装，以保证干燥减量在10%以下。6.5 保证期在规定的贮运条件下球抱白僵菌粉剂的保证期为6个月。从生产日期算起，至少6个月内抱子萌发率不低于标明值的80%。4 附录A(规范性附录)以松毛虫为目标昆虫的毒力测定A.1 供试虫种马尾松毛虫Dendrolimuspunctatus Walker A.2 试剂和材料麦芽浸精(生化试剂); 葡萄糖(医用); 吐温80(化学纯); 新洁尔灭(医用。A.3 仪器设备电子秤(千分之一精度); 加湿器(超声波低温加湿器); GB/T 25864一2010养虫笼(由30cmX3
16、0 cmX50 cm的木制框架构成，上下两面用木板，四个侧面用窗纱，有一个可以开关的侧门h三角瓶(250mL); 不锈钢慑子医用)。A.4 供试幼虫的饲养A. 4.1 蝇的采集在林间用带有橡皮头的慑子轻轻取F成熟的马尾松毛虫蝠，放入养虫笼内。每笼30只。保持温度在25c、相对湿度在80%以上(必要时用加湿器)。A.4.2 成虫的饲养和产卵待踊羽化后，同时放入1只250mL三角瓶水培的新鲜马尾松枝，作为成虫产卵的场所。一般成虫羽化后，当天或次晚交配，历时7h以上可以完成受精并产卵，7d10d为产卵高峰期。卵约7d开始孵化。A.4.3 幼虫的饲养在孵化高峰期，每天清除虫粪，用新洁尔灭消毒用过的器具
17、，并换上新鲜松枝饲养幼虫。幼虫生长7 d10 d以2龄幼虫为主，10d15 d以3龄幼虫为主。应选择虫龄一致、生理状态良好的健康幼虫作为毒力测定的供试幼虫。室内饲养一般不超过4代。A.5 接种感染准确称取2.00g低抱粉或0.20g高抱粉，加入0.1mL吐温80，置于高速搅拌器的盛液杯中，加入1%的麦芽浸粉液200mLo以5000 r/min速度搅拌2min，配制成1亿抱子/mL的待测样品悬浮液。每个养虫笼放入1只250mL三角瓶，装入水，插入新鲜松枝。挑选健康马尾松毛虫3龄幼虫30头，浸入待测样品悬浮液中2s，用捷纸吸掉余液，放入已在三角瓶中插好鲜松枝的养虫笼中。每个样品3次重复。以含有同样
18、浓度吐温80的麦芽浸粉液做对照，3次重复。置于温度在25oC、相对湿度在80%以上(必要时用加湿器)的环境中培养观察。每天换一次新鲜松枝。5 G/T 25864一2010处理的浓度剂量应不少于5个。每个处理30头试虫，至少重复3次。A.6 观察记录接种48h后开始检查死亡率，每24h记录一次。用慑子轻触虫体，无反应者计为死亡数。对照要放在另外的房间中，并用单独的慑子。对照的死亡率应小于10%，如果大于10%应重新测定。A.7 测定结果根据对照与处理的数据，采用Abbott表或按式CA.l)计算校正死亡率YC%):式中zY一一校正死亡率，%;Y1一一药剂处理样本的死亡率，%;Y2一一对照样本的死
19、亡率，%。Y=飞X100% =一一一一Xl-Y2 ._- .C A. 1) 然后，将处理浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法求出样品致死中时LTso。A.8 允许误差每次平行测定结果之差，应不大于20%。样品各剂量引起的死亡率应在10%90%之间。测LTso时，在50%死亡率上下应至少设置2个时间。6 附录B(规范性附录)以玉米摆为目标昆虫的毒力测定B.1 供试昆虫亚洲玉米膜。striniafurnacalis (Guenee) B.2 试剂和材料吐温80(化学纯); 酵母柑(化学纯); 维生素C(化学纯); 玉米粉(饲料用玉米，80oc烘干，过80目筛); 大豆粉(食用
20、大豆，800C烘干，过80目筛); 葡萄糖(食用); 氢氧化饵(分析纯); 氧化铀(分析纯); 磷酸氢二饵(分析纯); 磷酸二氢梆(分析纯); 琼脂条(凝股强度大于300g/cmz，食品用); 红霉素(医疗注射粉剂); 山梨酸(分析纯); LIJ梨酸饵(分析纯); 10%甲醒溶液(分析纯，甲醒溶于蒸锢水); 95%乙晖溶液(分析纯); GB/T 25864-2010 磷酸缓冲液(氧化铀8.5g;磷酸氢三饵6.0g，磷酸二氢饵3.0g，吐温802mL，蒸馆水1000mL); 微量移液器(200mL微量移攘器，对应的灭菌微量移液管); 搪瓷盘(25cmX 40 cm); 组织板(24孔板组织板。B
21、.3 仪器设备光学显微镜;血球计数板;水浴锅;医用手术刀;磨口三角瓶(250mL，具塞); 振荡器(100r/min-600 r/min); 养虫管(9cmX2.5 cm); 烧杯(50mL、500mL、1000 mL); 试管(18mm X 180 mm); 玻璃珠(直径5mm); 移液管(1mL、10mL); 7 GB/T 25864-2010 带塞磨口试管(10mL); 玻璃培养皿(9cm); 不锈钢慑子(医用)。B.4 玉米腹的饲养B. 4.1 饲料的配制饲料配方z玉米粉60g、酵母粉36g、黄豆粉60g、维生素C4. 0 g、山梨酸4.0g、10%甲醒1.6 mL、琼脂20g、蒸锢水
22、750mL。将藤糖、琼脂粉加入600mL的蒸锢水中调匀，搅拌煮沸，使琼脂完全溶化。玉米粉、黄豆粉、酵母粉用剩余的150mL水润湿浸泡。维生素C、山梨酸饵用少量水溶解。冷却至80.C加入黄豆粉、玉米粉等的润湿物，搅匀。稍等再将维生素C和山梨酸饵的混合液加入，搅匀。以微粒不下沉为标准，最后加入溶化的红霉素和甲醒溶液搅匀，置65.C水浴中，每个养虫管加入5mL饲料。凝固后保存于4.C 条件下待用。B.4.2 饲养取玉米膜的卵放人养虫盒中，保持温度在27.C士1.C，保持湿度在100%，约3d时间孵化出初孵幼虫。再将初孵幼虫转入已加入饲料的养虫管中，放置在27.C :J: 1 .C，湿度在75%100
23、%的环境中培养。B.4.3 供试昆虫的挑选培养5d后挑选供试幼虫，选择健康、活跃、个体大小一致的幼虫供试验用。B.5 待测样晶悬浮液的制备准确称取2.00g低抱粉或0.2g高抱粉，加入0.1mL吐温80，置于高速搅拌器的盛液杯中，加入200 mL 1%的麦芽浸粉液。以5000 r/min速度搅拌2min，配制成1亿抱子/mL的溶液。B.6 接虫感染将选好的幼虫10头一组，放入待测样品悬浮液的中浸2s，迅速取出，用滤纸吸掉多余水滴。放入已放置饲料的养虫管中，每处理做5管，塞上棉塞，写好标签。口朝下倾斜放置，27.C士1.C，保持湿度在75%100%，感染饲养120h。B.7 药效检查接种24h后
24、开始检查死亡率，每天检查一次。用慑子轻触虫体，元反应者计为死亡数。每天检查一次。记录死亡虫数。应注意先检查对照，并使用单独的慑子。对照的死亡率应小于10%，如果大于10%应重新测定。B.8 测定结果根据对照与处理的数据，采用Abbott表或按公式(A.1)计算校正死亡率Y(%)。然后，将处理浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法求出样品致死中时LTso。B.9 允许误差每次平行测定结果之差，应不大于20%。样品各剂量引起的死亡率应在10%90%之间。测LTso时，在50%死亡率上下应至少设置2个时间。8 C.1 球擅自僵菌产品分类C. 1. 1 球砸自僵菌高于自盼附录C(资
25、料性附录)白僵菌产晶分类GB/T 25864-2010 分生抱子含量为1000亿抱子/g以上、细度是全部通过160目筛的白僵菌菌粉。主要用于防治鳞翅目害虫。适用于对喷洒物细度要求较高的航空喷洒、静电喷洒等。C. 1.2 球砸自僵菌低于自盼抱子含量为80亿抱子/g、细度是全部通过35目筛的白僵菌菌粉。主要用于防治鳞翅目害虫。适用于一般喷粉器。C. 1.3 球拍白僵菌粉炮通过点燃引捻抛向或发射到空中后点爆扩散的白僵菌粉剂。适用于高山地区和树木较高的林区。C. 1.4 球抱白僵菌油悬浮剂以油类为介质的自僵菌液体制剂。适用于飞机喷洒。C. 1.5 球砸自僵茵挂条以元纺布或不同质地的纺织品为载体制成的杀
26、虫产品。主要用于防治黯翅目害虫。C.2 布氏臼僵菌粉荆以布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)为生产菌株，经过发酵和加工制成的，分生抱子含量为50100亿抱子/g、细度为全部通过35目筛的粉剂。主要用于防治地下害虫。9 OFON|叮mNH阁。国华人民共和国家标准球拍白僵菌粉剂GB/T 25864-2010 中祷中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 印张1字数18千字2011年2月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2011年2月第一版18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价* 书号:155066. 1-41545 GB/T 25864-2010 打印日期:2011年3月17日F002
