1、ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 25876-2010 牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法Method of nested PCR for sex identification of early cattle embryo 2011-01-10发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2011-06-01实施发布中华人民共和国国家标准牛旱期胚胎性别的鉴定巢式PCR法GB/T 25876-2010 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准
2、出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X1230 1/16 印张0.5字数7千字2011年2月第一版2011年2月第一次印刷* 书号:155066 1-41599定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010 )68533533 剧昌本标准的附录B为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位z华中农业大学。本标准主要起草人:张淑君、杨利国、李翔、刘辉、刘文举、胡修忠。G/T 25876-2010 I 牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法1 范围本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的
3、巢式PCR方法。本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定。2 规范性引用文件GB/T 25876-2010 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 巢式PCRtlstd polyrnerase chain reaction 利用两套PCR引物(巢式PCR引物对)进行两轮PCR扩增反应
4、，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下，作为DNA模板，进行第二轮扩增。3.2 SRY基因SRY gene 哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。3.3 HBB基因HBBge时卢珠蛋白基因，位于常染色体上。4 原理利用巢式PCR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的SRY基因片段进行扩增，以HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PCR扩增产物，根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。5 引物SR Yl 5/CTACTCCCCAACCGTCAGAAC 31 51 AGCCCAAACCCA TCAACCT A 31 SRY2 5/CCAGGGAACTGCTTGGGTA
5、 31 51 TGCTTCTCCACTT AGGCTCAA 31 HBB 5/TATCCCACTTACAAGGCAGGTT 31 1 GB/T 25876-2010 5GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA 3 6 试剂和仪器6. 1 主要试剂水应符合GB/T6682中灭菌双蒸水的要求。Taq DNA聚合酶及PCR缓冲液、100bp梯度DNA标记物。TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、澳化乙链等。具体制备方法参见附录A。6.2 主要仪器冷冻离心机、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸锢水器、微量移液器。7 检测方法7. 1 试样的制备与保存从待检胚
6、胎中分离4个(或4个以上)细胞，用元菌超纯水冲洗3次后，放入0.5mL PCR管中，加入10L元菌超纯水，100oC煮沸10min15 min，立即置于碎冰中，冷却后40C离心(8228g)5 min，取上清液保存于4oC冰箱中备用。7.2 SRY基因片段PCR扩增第一次扩增体系为20L:0.8mmol/L的dNTP、2U的TaqDNA聚合酶、0.2p.mol/L的SRY基因外引物SRY1和内参照引物HBB、10XPCR缓冲液、2.5mmol/L的氧化镖，加适量双蒸水;反应程序为95oC预变性5min ,94 oC变性30s ,60 oC退火30s , 72 oC延伸30s , 20个循环结束
7、后，72oC再延伸10 min,4 oC保温2min 10 mino 取第一次PCR扩增产物8L，作为第二次扩增模板，同时加入10XPCR缓冲液、2.5mmol/L的氧化镜、0.8mmol/L的dNTP1. 6L， 2U的TaqDNA聚合酶、O.2mol/L的SRY基因内引物SRY2和内参照引物HBB、适量的双蒸水至20L;反应程序为95oC预变性5min, 94 oC变性30s , 60 oC退火30s，720C延伸30s , 34个循环后，72oC再延伸10min , 4 oC保温2min10 min。7.3 结果判定取5LPCR扩增产物，1.O%1. 5%琼脂糖凝肢电泳(3V/cm5 V
8、/cm，电泳20min30 min) , 澳化乙键染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B.l.电泳图谱中出现558bp(HBB扩增产物)和219bp(SRY扩增产物)条带，判定为雄性胚胎;电泳图谱中只出现558bp条带，判定为雌性胚胎。2 试剂TE缓冲液10XPCR缓冲液琼脂糖电泳缓冲液加样缓冲液漠化乙链附录A(资料性附录)试剂和材料表.l试剂和材料配方10 mmol/L Tris-HC1CpH 8.0) , 1 mmol/L EDTACpH 8.0) GB/T 25876-2010 200 mmol/L Tris-HC1CpH 8.4) ,200 mmol/L 化饵，100mmol
9、/L硫酸钱，15mmol/L氯化筷242. 28 g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL O. 5 mol/L EDTACpH 8.0)，加双蒸水定容至1 000 r，使用时50倍稀释0.25%澳盼蓝(质量浓度)，40%煎糖(质量浓度)。100 mL双蒸水中加入O.1 g漠化乙链，搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶，锡锚包裹、备用EON-hNH因。GB/T 25876-2010 附录(规范性附录)SRY基因和内参基因巢式PCR产物电泳图i昔与结果判断示意图B 8 9 bp 7 6 5 4 3 2 M M为100bp梯度DNA标记物;泳道1-4均为雌性胚胎样本，检出558bp条带;泳道5-8均为雄性胚胎样本，检出558bp和219bp两个条带。图B.1 SRY基因和内参基因巢式PCR产物电泳图语与结果判读示意图侵权必究n旧dnHd 严hd-1tA AA立-1A- pnv pnu U zo Fhu -EA-E E-号一价书一定等版权专有14.00 主已GB/T 25876-2010 打印H期:2011年3月30日F002A
