1、ICS 65.020.30 B 41 中华人民11: -、道雪和国国家标准GB/T 25878-2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法Polymerase chain reaction CPCR) method for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (lHHNV) 2011-01-10发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会2011-06-01实施发布GB/T 25878-2010 目U昌本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业
2、部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。本标准主要起草人:黄佳、杨冰、朱泽闻、宋晓玲、孙喜模、赵红萍、刘莉。I GB/T 25878-2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法警告:使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR)检测方法的原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。本
3、标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒(lHHNV)的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T 7202. 1-2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分:压片显微镜检查法SC/T 7202. 2-2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分:PCR检
4、测法3 原理3. 1 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectioushypodermal and haematopoietic necrosis virus , IHHNV)粒子大小为20nm22 nm，是无囊膜二十面体，在氧化铠中的浮力密度为1.40 g/mL，含线状单链DNA，长度为4.1kb，衣壳由4个分子质量分别为74kD、47kD、39kD、37.S kD的多肤组成。IHHNV可感染世界各地的养殖对虾，其感染细角滨对虾(Lit。如naeusstylirostris)会引起急性传染病和高死亡率(90%)，稚虾受到的危害最严重。IHHNV感
5、染凡纳滨对虾(Litoenaeusvannamei) 会引起慢性矮小残缺综合症(RDS)，主要影响是患病对虾生长缓慢，畸形，受感染存活对虾终生带毒，通过垂直和水平传播。3.2 技术原理IHHNV的聚合酶链式反应(polymerasechain reaction , PCR)是以IHHNV的一段389个碱基(b)长度的特异性DNA序列作为模板，以与模板两端序列互补的一对特异性寡核昔酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核昔三磷酸存在下，利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用，经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增
6、的片段，从而揭示微量IHHNVDNA的存在。4 试剂和材料4.1 所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外，按照SC/T7202. 2-2007中第5章的规定。4.2 100 ng/L引物F:S-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3, -20 oC保存。4.3 100 ng/L引物R:S-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3，-20 oC保存。4.4 阳性对照为已知IHHNV阳性的组织样品的DNA模板，一200C保存。1 GB/T 25878-2010 4.5 阴性对照为已知IHHNV阴性的组织样品的DNA模板，一20.C保存。4.6 空白对照以元菌双蒸水
7、为模板。5 仪器和设备所需仪器设备按照SC/T7202. 2-2007中第6章的规定。6 操作步骤6. 1 反应体系的准备6.1.1 PCR反应体系的准备应在洁净区完成。6.1.2 PCR反应可选择25L，50L或100L反应体系进行。6.1.3 在PCR前区按表1的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，配制成元酶反应预混物。保存于一20.C。在临用前，根据所需的反应份数，取出元酶反应预混物，加入相应体积的Taq酶，混匀，即成完全的反应预混物。按1份/支分装到0.2mL PCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加入50L液体石蜡。暂存于4.C。表1100份PCR反应预混物所需试剂组成试
8、剂25L体系50L体系100L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液(元Mi+)250L 500L 1000L 1X 氯化簇(25mmol/L) 200L 400L 800L 2.0 mmol/L dNTP C1 0 mmol/L) 100L 200L 400L 400mol/L 100 ng/L引物F75L 150L 300L 3 ng/L 100 ng/L引物R75L 150L 300L 3 ng/L 灭菌双蒸水1 725L 3450L 6 900L Taq DNA聚合酶(5U/JJ.U 25L 50L 100L 0.05 U/L 100份反应总体积2 450L 4900L 9800L 注1:2
9、5L体系模板笠0.5L/反应管。注2:50L体系模板耸1L/反应管注3:100L体系模板量2L/反应管。6.2 样品准备6.2.1 样品的处理应在样品区完成。6.2.2 样品采集的要求按SC/T7202. 1-2007中附录B的规定执行。6.2.3 活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg100 mg(去掉稚虾眼)。活体或冰冻的虾腿、胃、游泳足或步足样品约5mg100 mg。活体或冰冻饵料生物样品约5mg100 mg。池底表土样品约500mg。将上述待检样品放入灭菌1.5 mL微型离心管中，应避免各样品间的交叉污染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的有效
10、氯含量为3.0X 10-3的含氯消毒剂中5min，经元PCR产物污染的自来水充分清洗，再经蒸锢水淋洗后方可用于下一个样品。6.3 DNA的提取按照SC/T7202. 2-2007中7.1.3的规定执行。6.4 PCR扩增6.4.1 在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有1份反应预混物的PCR管内加入相应体积的各样品DNA提取液，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。6.4.2 将上述加有样品模板的PCR管带入PCR后区，置于PCR仪中按以下程序进行扩增:95 .C GB/T 25878-2010 5 min;95 .C 30 s、55.C30 s , 72 .C 1 mi
11、n，35个循环;72.C延伸7mi口，最后4.C保温。准备进行产物的电泳。6.5 PCR产物电泳按照SC/T7202. 22007中7.1. 57. 1. 8的规定执行。7 结果判定7. 1 阳性对照和阳性样品在389bp处应有一条特定条带出现;阴性对照和阴性样品在389bp处应元条带出现，空白对照不出现任何条带。阳性对照在389bp处元特定条带出现或阴性对照在389bp处有条带出现都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒CIHHNV)PCR检测产物序列参见附录A。7.2 条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。7.3 阳
12、性结果表明被检样品中存在IHHNVDNA。对活虾和敏感宿主而亩，提示已受IHHNV感染;对冰鲜或冰冻对虾而言，提示曾受到IHHNV感染。7.4 电泳结果的分析和问题排除方法参见附录B.3 GB/T 25878-2010 附录A (资料性附录)对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR)检测产物序列1 GAGGAGAGAG CTGT且GTAGCGGA且CACAACCCGACTTTAT TGA且GGGACTCCCAACGG且CF 61 CGGACGA且ATGGACGGAAGG CGACTGGAAG 且GAGTG且GATTG且TAAAC且且GTGGA且且GTA121 CAA
13、CATGGTA CACCTTCGTC ATCAGAGAA且且ACCACAACCAAGAAGACTC TCCGGACGA且181 CGCCAAACTT CACCATTACA GATCATGGTG ACCACTGGCA CATCACATAC TCCGGACACC 241 CAACCAATAA GACCAGAC且TAGAGCT且CAATCCTCGCCTA TTTGGGAGTT 且CCTTTGCTG301 CCAGAGCCGA 且GCTGAAGCGACTACGGTAC TTGTT且GA且且TATCA且GAGATGGATACTCT 361 ATCTTATCAG 且TACGGTATTG且ACGGCTTTC
14、GTATTTTGG TCTTGGCCAC GCCATTTTT且R 图A.l对虾IHHNVPCR检测产物序列4 GB/T 25878-2010 附录B(资料性附录)对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(1田剧V)聚合酶链式反应(PCR)检测电泳结果分析和问题排除方法表B.1对虾IHHNVPCR检测电泳结果分析和问题排除方法试验结果结果判读及原因分析问题排除对虾样品阳性对照和阳性样品在389bp处有条带，阴性对1.PCR反应正常，结果有效照和空白对照元389bp 条带阳性对照有条带，但分1.分子质量标准失效或加样盐子质量标准没有影像太少更换分子质量标准或增加其加样量分子质量标准有影像，1. PCR反应
15、失败检查并更换PCR反应所用试剂以及PCR程序是否正确但阳性对照元条带2.阳性对照失效更换阳性对照，重新实验1.微量移液器污染清洗微量移液器，只能用PCR后区的微量移液器取反应产物2.试剂污染更换试剂阴性对照或空白对照在389bp处有条带出现3.环境污染清洁实验室及所用仪器设备，见SC/T7202.2一2007中的附录B4.操作污染禁止从PCR后区到PCR前区的交流，加强操作隔离阳性对照和阴性对照1. DNA提取失败或降解检查提取DNA所用试剂情况，重新试验，确认样品新鲜程度组正常，但已知带毒样品元条带2. DNA浓度过高将样品稀释10倍以上3. PCR抑制物介入稀释样品10倍以上，或重新提取
16、DNA1.未注意热启动操作，使PCR做好热启动操作。样品先要加到PCR管盖上，分子质量标准正常，但出现非特异性扩增反应预混物预热后，短暂离心(1s2 s)以混入样阳性对照、阴性对照和样品品，迅速放回预热PCR仪中出现较多杂带或明显的弥2.酶活性、dNTP浓度或+确认预混物制备的准确性、试剂质量，对不同散区浓度差异批次的酶重新测定最佳Mg2+离子浓度3.温度控制异常检查PCR仪是否复性温度过低1.紫外观察仪故障检查紫外观察仪凝胶上元任何影像，包括DNA分子质盐标准2.背景发红太亮减少澳化乙键(EB)a用茧，将琼脂糖凝胶置于清水中30min后再观察结果5 GB/T 25878-2010 表B.l(
17、续)试验结果结果判读及原因分析问题排除3.凝胶太厚重新制作琼脂糖凝胶片凝胶上无任何影像，包4.电极颠倒或电泳时间过长改正电极方向，重新加样电泳括DNA分子质量标准5.漠化乙链(EB)分解失效重新配制澳化乙链(EB)a漠化乙键(EB)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按SC/T7202.2-2007中附录B的规定执行。6 EON-h的NH阁。华人民共和国家标准对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法GB/T 25878-2010 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷印张O.75 字数10千字2011年2月第一次印刷开本880X12301/16 2011年2月第一版母书号:155066. 1-41601 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价GB/T 25878-2010 打印日期:2011年3月30日F002A
