1、GB/T 4789. 13-2003 90 前本标准对GB/T4789. 13-194食品卫生微生物学检验产气英膜梭菌检验进行修订e本标准与GB/T4789. 13-1994相比主要修改如下2按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。修改并规范原标准中的设备和材料。本标准自实施之日起.G13/T4789. 13-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位2卫生部兰州生物制品研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人=王成怀、冉陆、付萍、姚景会。本标准于1984年首次发布，1994年第次修订，本次为第二次修订。1 范围食品卫生
2、微生物学检验产气英膜梭菌检验本标准规定了产气英膜梭菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中产气英膜梭菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789. 13-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 冰箱:OC4C。3.2 恒温培养箱:36C士lC，3. 3 恒温水浴
3、锅2460C土1C。3.4 显微镜:10X-100X。3.5 均质器或灭菌乳钵。3. 6 厌氧培养装置常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式。3.7 灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。3.8 灭菌试管:16 mmX 160 mm, 3.9 灭菌平皿=直径90mmo 3. 10 灭菌锥形瓶:500mL, 4 培养基和试剂4. 1 应肉培养基:GB/T4789. 28-2003中4.67 , 4.2 亚硫酸盐-多粘菌素磺胶略晓琼脂(SP曰:GB/T4789. 28-2003中4.69。4.3 液体硫乙醇酸盐培养基(FTl:GB/T 4789. 28-2003中4
4、.70，4.4 动力硝酸盐培养基:GB/T4789. 28-2003中4.72，4.5 含铁牛奶培养基:GB/T4789. 28-2003中4.71 , 4.6 卵黄琼脂培养基:GB/T4789. 28-2003中4.68 , 4. 7 O. 1 %蛋白陈水:GB/T4789. 28-2003中4.85。4.8 硝酸盐还原试剂:GB/T4789. 28-2003中3.17。4.9 革兰氏染色液:GB/T4789. 28-2003中2.2，5 检验程序产气英膜梭菌检验程序见图1。91 GB/T 4789. 13-2003 植样25 g(mL)检样+225mL O. l置自脏水剂均属、离心、稽10
5、-2 103 10 10 10-6 稀，事檀稀穰精释液稀再被稀挥液+ + + + + SPS SPS SPS SPS SPS 琼腊梅黯脂混琼腊混璋躏擅瑭躏混合倾在合倾注合倾症合倾注告倾注固16 操作步骤6. 1 活菌计数培养6. 1. 1 按无菌操作称取食品检样25g(mL)放人均质器中，加0.1%蛋白陈水225mL，低速搅动1 min- 2 min，使之均质化，作为1 10稀释液。6. 1. 2 以上述1 10稀释的均质液按1mL加0.1%蛋白陈水9mL做成10210的系列稀释液。6. 1. 3 吸取各稀释液1mL分别放入两个灭菌平皿内。每个平皿浇注约50C的SPS琼脂15mL 20 mL.
6、仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。6. 1. 4 上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于36C土1C培养24h。6. 1. 5 选取长有30个300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。92 GB/T 4789. 13-2003 6.2 确证试验6. 2. 1 由平板上任取10个黑色菌落，分别按种FT培养基，于36C士1C培养18h24 h。6.2.2 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检.产气英膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽泡，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。6.2.3 用接种环(针穿刺接种动力-硝酸盐培养基.于36C士1C培养24h，观察接种线的生长情况，判
7、断有元动力。然后，滴加甲荼胶液和对氨基苯磺酸液各0.5mL，观察硝酸盐是否被还原。产气英膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。6.2.4 取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46C水浴中培养2h后观察有无暴烈发障现象，5h内不发酵者为阴性。产气英膜梭菌发障乳糖，凝固酶蛋白并大量产气，呈暴烈发酵现象，B培养基不变黑。6.2.5 用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每张平板至少可接种10点)，于36C土1C厌氧培养24h，观察接种点的变化。产气英膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。6.3 菌数计算根据黑色菌落的计数(6.1.5)和确证试验的结果(6.2)，计算每克(毫升)食品检样的含菌数。例如10-稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供做确证试验的10个菌落中有7个被确证为产气英膜梭菌，则每克(毫升)食品检样所含产气英膜梭菌数为100 X O. 7 X 10 = 7 X 105 93
