1、GB/T 4789. 14-2003 96 前言本标准对GB/T4789. 14-1994(食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验进行修订。本标准与GB/T4789. 141994相比主要修改如下=一一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。一修改并规范原标准中的设备和材料。本标准自实施之日起，GB/T4789. 14-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位=中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人2白竞玉、付萍、杨宝兰、姚景会。本标准于1984年首次发布，1994年第次修订，本次为第二次修订。1 范围食品卫生微生物学检验蜡样
2、芽胞杆菌检验本标准规定了蜡样芽跑杆菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中蜡样芽胞杆菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789. 14-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.2 食品卫生微生物学检验商落总数测定GB/T 4789. 28 2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 冰箱，O.C4C。3.2 恒
3、温培养箱，36C:1:1.C.3.3 恒温水浴锅，46C:1:1C。3.4 显微镜，lOX100X。3.5 均质器或灭菌乳钵，3.6 架盘药物天平，0 g500 g，精确至0.5g。3. 7 灭菌锥形瓶，500mL。3.8 灭菌试管，16mmX 160 mm. 3.9 灭菌吸管，1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。3. 10 灭菌平培养皿g直径90mm. 3. 11 灭菌刀、剪、银子等。4 培养基和试剂4. 1 肉浸液肉汤培养基，GB/T4789. 28-2003中4.1. 4.2 酷蛋白琼脂培养基，GB/T4789. 28-2003中4.65。4.3 动力硝酸盐培养基
4、，GB/T4789. 28-2003中4.72.4.4 缓冲葡萄糖蛋白陈水，GB/T4789. 28-2003中3.4. 4.5 血琼脂培养基，GB/T4789. 28-2003中4.6。4.6 3%过氧化氢溶液。4. 7 甲茶胶乙酸溶液，GB/T4789. 28一2003中3.17。4.8 对氨基苯磺酸乙酸溶液，GB/T4789.28-2003中3.17。4.9 革兰氏染色液，GB/T4789. 28-2003中2.2.4. 10 甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基，GB/T4789.28-2003中4.64。4. 11 O. 5 %碱性复红染色液，GB/T4789. 28-2003中2
5、.8。97 G/T 4789. 14-2003 4. 12 木糖-明胶培养基GB/T4 789. 282003中4.66，5 检验程序蜡样芽胞杆菌检验程序见图1。检样25 g(mL) 1Il 225 mL生理盐水做成10-1 10-5的稀释液37 C, 18h-24h 选择性培养基选择性培葬基(菌数测定分离培养】岛在ypMYP 36 土1(:12 h - 20 h 36(:士1(:12h-2( 菌数计算营养琼脂培#基L 生*且菌革观事染色幢幢生化试验菌株保存报告图16 操作步骤6. 1 菌鼓测定以无菌操作将检样25g(mL)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1 10-5的稀释液按GB/T
6、 4789.2测定。取各稀释液O.1 mL，接种在两个选择性培养基一甘露肆卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置36(;士1(;培养12h20 h，选取适当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色(表示不发酵甘露醇)周围有粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计数后，从中挑取五个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡祥芽胞杆菌的商落数计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克(毫升)样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如z将O.1 mL 10-样品稀释液涂布于MYP平板上，其可疑菌落为25个，取五个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽胞杆菌，则1g (mL)检样中所含蜡样
7、芽胞杆菌数为z25 X 4/5 X 10 X 10 = 2 X 10 6.2 分离培养取检样或稀释液划线分离于选择性培养基(MYP)上，置37(;培养12h20 h，挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌落(见6.1)接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，然后做证实试验。6.3 证实试验6.3. 1 形态观察本菌为革兰氏阳性大杆菌，宽度在1m或1m以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中98 央或稍偏于一端。6.3.2 培养特性GB/T 4789. 14-2003 本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化;在普通琼脂平板上其菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐。6.3.3 生化性状及
8、生化分型6.3.3.1 生化性状本菌有动力;能产生卵磷脂酶和酷蛋白酶;过氧氢酶试验阳性，溶血;不发酵甘露醇和木糖;常能液化明胶和使硝酸盐还原;在厌氧条件下能发酵葡萄糖。6.3.3.2 生化分型根据蜡样芽胞杆菌对拧橡酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、v-p反应、明胶液化性状的试验，分成不同型别，见表10 表1蜡样芽胞杆菌生化分型生化试验型别拧橡酸盐利用硝酸盐还原淀粉水解v-p反应明胶液化1 + 十+ + + 2 + + + 十3 + + + + 4 + 十+ 5 十+ 6 + + 十7 十十十十8 + + 十9 十+ 10 + 十+ 11 十十十+ 12 + 十+ 13 + 14 十十15 + 十
9、十6.3.4 与类似菌鉴别本菌与其他类似菌的鉴别见表2。表2蜡样芽胞杆菌与其他类似菌的鉴别项目巨大芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌苏E金芽胞杆菌草状芽胞杆菌炭瘟芽胞抨菌过氧化氢酶+ + + 十十动力 土士硝酸盐还原+ 十+ 十酷蛋白分解士+ 土 丰卵黄反应十+ + + 99 GB/T 4789. 14-2003 襄2(续)项目巨大芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌苏E金芽胞杆菌状芽胞杆菌炭瘟芽胞杆菌葡萄糖利用(厌氧)十+ + - 甘露自事+ 本糖士溶血+ 十平平已知致病菌特性产生肠毒素对昆虫致病假根样生长对动物和人致病的内毒素结晶注十90%-100%的菌株阳性事-90%-100%的菌株阴性$士大多数菌株限性g平大多数菌株阴性e本菌在生化性状上与苏云菌芽胞杆菌极为相似，但后者可籍细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法如下:取营养琼脂上纯培养物少许，加少量蒸馆水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥，然后漓加0.5%碱性复红液，并用酒精灯加热至微见蒸气维持1.5 mnt移去酒精灯，将玻片放置半分钟，倾去染液，置洁净自来水充分漂洗、隙子、镜检。在泊浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红色结晶小体(如未形成游离芽胞，培养物应放室温再保存1d2 d后检查).如有即为苏云金芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌检查为阴性。100
