1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验酵米面亚种检验Microbiological examination of food hygiene Examination of Pseudomonas COCQvenenans subsp. farinofernumtans 1 主题内容与适用范围G/T 4789.29-94 本标准规定了椰毒假单胞菌酵米面亚种检验的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及菌种鉴定。2 引用标准GB 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB 1167
2、5 银耳卫生标准3 设备和仪器3. 1 超净工作台。3. 2 采样勺。3. 3 灭菌平皿s直径9cm , 12 cmo 3. 4 灭菌试管、吸管。3. 5 灭离角瓶，100tnL.500 mL。3. 6 灭菌L形玻璃棒.3. 7 灭菌透明玻璃纸、滤纸。3.8 小试管(血清凝集试验用)。3. 9 离心管。3. 10 玻璃漏斗。3. 11 接种针、接种环。3. 12 酒精灯。3. 13 玻片、染色缸。3. 14 显微镜(带泊镜头)。3. 15 天平。3.16 pH 计。3. 17 恒温水浴锅。3.18 恒温培养箱，36士1C、26士1C。中华人民共和国卫生部1994-01-24批准1994-08-
3、01实施321 GB/T 4789. 29-94 3. 19 电冰箱，420C 3. 20 离心机，4000r/mino 4 培弊基和试J4.1 革兰氏染色液z按GB4789.28配制。4.2 氧化酶试验z按GB4789.28执行。4.3 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，按GB4789.28配制。4.4 马铃薯葡萄糖半固体琼脂z按4.3PDA配方，琼脂量减至0.5g/100 mL。4.5 马铃薯葡萄糖水(PD水h按4.3PDA配方，不加琼脂。4.6 GVC增菌液(椰毒假单胞菌酵米面亚种增菌用)，在高压灭菌的PD水(4.5)中，以无菌手续加龙胆紫水溶液(最终浓度为1/10万)，氯霉素水溶液(最终浓度
4、为20用/mL)，混匀、分装后置4C备用。4. 7 卵黄琼腊z按GB4789.28配制。4.8 SS琼脂g按GB4789.28配制。4.9 Hugh-Leifson培养基，(O/F试验用)，按GB4789.28配制。4.10 蛋白陈水(航基质试验用)，按GB4789.28配制。4.11 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用)，按GB4789. 28配制。4. 12 西蒙氏拧橡酸盐培养基E按GB4789.28配制。4.13 苯丙氨酸培养基s按GB4789.28配制。4.14 糖发酵管=按GB4789.28配和tl0 4.15 半固体琼腊s按GB4789. 28配制。4. 16 抗0多价血清、型特
5、异性因子血清(0-1、0-1V、O-v、O-Vl、0-1型、。哑型)。5 检验程序椰毒假单胞菌酵米面亚种检验程序如下z322 6 操作步骤6. 1 增菌G/T 4789.29-94 幢样增菌淀粉类食品25g+225mLGVC.增菌掖鲜银耳19+20mLGVC增菌液用无菌操作取样品25g，加入盛有225mL增菌液的500mL兰角瓶中(鲜银耳祥品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mL增菌液的100mL三角瓶中放36士1.C培养48h。6.2 分离、纯化培养取增菌液1接种环，划线接种PDA平板，36:l:1c培养2448h。观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验。革兰氏
6、染色阴性，氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及ss琼脂平板，36土1.C分别培养48h和24h。椰毒假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征见表10培养基PDA平板表1菌落特征菌落12mm，灰白色或乳白色，光滑、湿润、边缘整齐.培养48h后，中心有凸起，呈草帽状，菌落周围有黄绿色素扩散到基质中323 GB/T 4789.29 94 续表1培养基菌落特征卵黄琼脂平板菌藩表面光靖、湿润，48h后，菌落周围形成乳白色漉浊环，斜射日光下可见环的表团呈虹彩现象5S琼脂平板不生长从卵黄琼脂平板挑取卵磷脂酶阳性，并带有虹彩环的单个菌落，接种PDA斜面.36士1C培养24 h;供下步试验用。6.3 生
7、化试验从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种Hugh-Leifson培养基、蛋白陈水、缓冲蛋白脐、水、西蒙氏拧橡酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基.36士1C培养，按单项试验的要求分别进行观察。椰毒假单胞菌酵米面亚种生理生化性状见表2。阳性动力。IF试验(0型葡萄糖果糖糖半乳糖阿拉伯糖甘露醇肌醇卫茅醇硝酸盐还原6.4 血清学分型鉴定6.4.1 。抗原的和j备表2尿素明胶液化卵磷脂酶侧金盏花醇拧橡酸盐利用精氨酸石蕃牛乳37 C生长阴性氧化酶舵基质v-p MR H，5产生5 c不生辰41 C不生长将马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面36士1C. 24 h培养物用灭菌生理盐水洗下，煮沸2h.再用
8、灭菌生理盐水稀释至5-10亿/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。6.4.2 0抗原的鉴定用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用。一I，O-IV、0-v、0町、0-11、0田园子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定。抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化学性状符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进-步的鉴定.6.5 毒性试验6.5.1 产毒培养取己鉴定为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面.36土1C.培养24h.加入3mL灭菌生理盐水，制成约100亿/mL的菌悬液，用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上，用灭菌L形玻璃棒
9、涂布均匀.26士1C培养5do取下带菌的玻璃纸，将半困体平板放入消毒锅324 GB/T 4789. 29-94 内.100C流动蒸气灭菌30min。室温冷却后，置10-20 C冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用灭菌吸管取出冻融液，经滤纸过滤放灭菌试管或兰角瓶中.4C避光保存，此为粗毒素。6.5.2 毒力测定取粗毒素或经水浴蒸发的510倍浓缩液0.5mL.灌胃小自鼠3只，体重1820g.观察7d。若菌株产生米酵菌酸，小白鼠在灌胃后20min24 h内发病、死亡。主要症状为竖毛，萎靡不振，继而躁动，行步蹒跚、股体麻痹、瘫软、抽搞，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。6.5.3 米酵菌酸测定按照GB11675执行。附加说明:本标准由卫生部卫生监督司提出.本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所及卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人孟昭赫、刘秀梅、自竟玉。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。325
