1、GB/T 4789.31-2003 前本标准对GB/T4789.31一1994(食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌肠杆菌科噬菌体检验方法进行修订。250 本标准与GB/T4789. 31-1994相比主要修改如下=按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。规范原标准中的设备和材料。本标准自实施之日起，GB/T4789.31一1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位2江西省卫生防疫站、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人z何晓青、付萍、计融。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。GB/T 4789
2、.31-2003 1 范围食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏商、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 478
3、9.4 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB/T 4789.5-2003 食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB/T 4789. 6 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希民菌检验GB/T 4789. 28 2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 恒温培养箱:36 c土rc。3.2 水平仪。3.3 灭菌培养皿:直径90mm。3.4 定量滴管3每滴约10JLL。输液用的灭菌玻璃接管配4专号针头。3.5 灭菌棉签。4 培养基和试剂4. 1 营养琼脂、营养肉汤z按GB/T4789.28-2003中3.7和3.8进行。4.2 蛋白陈水、能基质试剂:按GB/T4789. 28-
4、2003中2.13进行。4.3 三糖铁琼脂z按GB/T4789. 28-2003中3.24和3.25进行。4.4 肠杆菌科诊断用噬菌体.7种和3种。安顿启开后用元菌毛细吸管吸出移入灭菌小试管内，用元菌胶塞塞紧，放于4c冰箱备用。5 检验程序5. 1 肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序见图1。251 GB/T 4789.31-2003 栓样前增菌、增菌和分离，按GBI丁4789.4挑取可疑菌曹图1肠杆菌科诊断用噬菌体检验沙门氏菌的程序252 GB/T 4789.31-2003 5.2 肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序见图2。捡样增菌和分离，按GB厅4789.5揽取可疑菌事TSI葡萄黯半
5、团体TSI底层产酸，斜面产赢.H2S 非如左述的不产气，无动力各种反应结果噬菌体试验Sh裂解，井呈现Sh不裂解各种裂解模式血晴学试验与裂解模式相符血清学试验与裂解模式不相持或且植1RTD Sh裂解不披1RTD Sh裂解葡萄糖镀试验生化分群试验必要时加做L醺曲、克民拧橡酸盐、粘液酸、七叶昔、水幅曹试验J志贺氏菌属葡萄糖镀+非志贺氏菌非主1Il氏菌分群且分型结果或任何其他阳性结果非革贾民菌报告图2肠杆菌科诊断用噬菌体检验志贺氏菌的程序253 GBjT 4789.31-2003 5.3 肠杆菌科诊断用噬菌体检验致泻大肠埃希氏菌的程序见图3。栓样增离和分寓，按GBiT4789.6 乳黯盎酵或不盎酷的菌
6、蓓3个-5个咂菌体试验E和或Sh、E-4E和或Sh、E-4各种晒菌体均不裂解咂商体不裂解，噬菌体裂解氧化酶 (-杆菌其他幢菌体裂解不同来源分离的菌株T日，航基盾，其裂解模式pH 7.2尿章.KCN. 具有同一性赖氨酸，动力rSI底层+非如左边的各种反应结果H，S一，KCN一尿章一血清学试验E1EC+ EPEC+菌EIEC+ 非如左述的EHEC(0157) 各种反应结果赖草酸一，自童基Jli+. 动力( 0124葫力十/-)踊毒章+非大黯产肠毒章大局道致病性或脑道僵噩性非致南大非大肠在希民菌局埃希氏菌局道出血性大踊埃希氏菌肠辑希民菌埃希民菌l大肠埃希民菌报告图3肠杆菌科诊断用噬菌体检验敖泻大肠埃
7、希氏菌的程序254 6 检验步骤6. 1 前增菌、增菌和分离6. 1. 1 沙门民菌的前增菌、增菌和分离，按GB/T4789.4进行。6. 1.2 志贺氏菌的增菌和分离，按GIl/T4789.5进行。6. 1. 3 致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离，按GB/T4789.6进行。6. 2 噬菌体试验6. 2. 1 培养基准备GB/T 4789.31-2003 营养琼脂平板(含琼脂1%1.5%，琼脂量视其凝固性而定，约为一般用量的四分之三)，每个90 mm培养皿中约25mL，放在水平台面上俊其凝固，翻转平板，在36C半开皿倒置约1h，以烘干培养基表面水分，并使琼脂具有显著的吸水性。6.2.2 试验菌液
8、的准备从选择性鉴别平板上挑取菌落，一般应多挑几个菌落，以防遗漏。检验沙门氏菌时，不但应挑取乳糖阴性产H，S和不产H，S的菌落，还应挑取乳糖阳性产H，S的菌落。检验大肠埃希氏菌时应挑取乳糖阳性或阴性的菌落3个5个。检验志贺氏菌时应挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体管，于36C培养过夜，次日选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产H，S，不产气无动力的培养物。下述两种方法可供选用。6.2.2.1 法z将待试菌落接种于营养肉汤管内，于36C培养过夜。挑取此肉汤培养物一满环，稀释于盛有1rnL2 mL蛋白陈水的试管内，使成为(1, 200) ( , 400)稀释菌液，含菌量约为1X 10 /mL, 6
9、.2.2.2 二法用接种针在鉴别平板上轻轻蘸取可疑菌落，挑取商量不宜过多，稀释于盛有1mL 2 mL蛋白陈水的试管内，使其含菌量约与一法相似。6.2.3 涂抹试验菌液6.2.3.1 斑点涂抹法z将营养琼脂平板表面自圆心起分为三等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物，每挑取试验菌液一满环，涂抹直径约1cm的菌斑一个。每株培养物涂抹七个菌斑，外圈四个，内圈二个。6.2.3.2 棉签涂抹法:用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面二分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离。略等数分钟，待菌液干燥。6. 2. 4 i商加噬菌体用定量乳头滴管在一个菌斑上滴加噬菌体一滴，依次为。1、C
10、、Sh、E、CE、E才和Ent。滴管上安装4号针头，每毫升约为100滴。每支滴管只滴加一种噬菌体，针尖绝对不能接触平板表面，严格防止交叉污染。每用一支滴管，可把全部待试菌应滴加噬菌体的菌斑部位全部滴加完毕。滴加噬菌体时必须将琼脂平板放在水平台面上。7种噬菌体滴加完毕后，赂等数分钟，待噬菌体液干燥。翻转平板，放36C培养5h6 h，并过夜各观察一次结果。如果仅有一两株培养物作噬菌体试验，则可用直径为3mm的接种环挑取噬菌体，依次滴加在菌斑上。灼热的接种环必须完全冷却以后方可挑取噬茵体。6.2.5 试验结果的判定按表1判定噬菌体试验的结果。必要时吸取少许剩余的蛋白陈水培养物作能基质试验，大肠埃希氏
11、菌培养物一般为能基质阳性。255 GB/T 4789.31-2003 襄1肠轩菌科噬菌体诊断表噬菌体裂解模式序号0- 1 C Sh E CE E.4 1 CL 飞Z CL CL 3 CL (一)(-) 4 CL 5 CL CL 6 CL 7 CL 8 CL 9 (一) 。注2CL融合性裂解z不裂解，.裂解或不裂解，(-)很少菌株裂解。a结合菌型预测，见表3.6.2.6 供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法采用如下三种噬菌体ga) 沙门民菌C-j噬菌体sb) E多价噬菌体，包括E和Sh，c) C多价噬菌体，包括C、CE和Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。判定结果Ent 沙门氏菌属沙门民菌属
12、(援基质大肠埃希氏菌键基质十)弗劳地氏拧橡酸杆菌志贺氏菌属画、大肠埃希民菌大肠埃希氏菌大肠埃希民菌弗劳地氏拧穰酸抒菌、大肠埃希氏菌大肠埃希民蘑CL 阴沟肠杆菌噬菌体阴性菌株(用生化试验鉴定)涂抹试验菌液z斑点涂抹法将琼脂平板表面分为四等份，每等份可供涂抹一株细菌培养物。每株培养物涂抹三个菌斑，外圈两个，内圈一个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹五条菌带。略等数分钟，待菌斑干燥。依次滴加上述三种噬菌体，在36C培养5h6 h和过夜，各观察一次结果。按表2判定简化诊断法的结果。表2三滴法噬菌体试验简化诊断表0- 1 E多价C多价判定结果CL 沙门氏菌属 CL 大肠埃希
13、氏菌CL 弗劳地氏拧攘酸杆菌a噬茵体阴性培养物注tCL 融合性裂解g一不裂解尸裂解或不裂解。a包括阴沟llli杆菌和少数大llli埃希氏菌。6.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验有少数的沙门氏菌培养物不被o-r噬菌体裂解，并有少数的大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体256 GB/T 4789.31-2003 裂解。故应将不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂。以下分别按GB/T4789. 4和GB/T 4789. 6进行。6.4 血清学分型鉴定6.4. 1 沙门氏菌按GB/T4789.4进行。6.4.2 致泻大肠埃希民菌按GB/T4789. 6进行。6.4.3 志贺氏菌6. 4. 3. 1
14、记录噬菌体试验的结果，并按表3判定血清学分型鉴定的方向。Sh噬菌体不裂解的培养物不属于志贺氏菌.已知全部志贺氏菌培养物均能被Sh噬菌体裂解，且将其稀释至1RTD时，有99%的志贺氏菌培养物仍应被裂解。表3噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的方向噬菌体裂解模式志贺氏菌血清学分型序号鉴定的方向。1C Sh E CE E-4 Ent 4-1 CL CL CL CL 福氏1-5.(鲍氏)福氏1，4，荆疾2.鲍氏4-2 CL CL CL 5.7.11 , 16.17. (宋内氏1)4-3 CL CL 宋内氏1.摘疾2.福氏4.鲍氏5.16.4-4 CL CL CL 宋内氏I!.福氏3福氏6.鲍氏1
15、-4，偶4-5 CL 数型6-18(除16外) 荆疾3-124-6 CL CL 鲍氏9.154-7 CL CL 喇疾，(宋内氏I!)5-1 CL CL 鲍氏13注:CL融合性裂解s不裂解，()内为罕见的结果。挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集试验。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查。6.4.3.2 如按噬菌体裂解模式提示为福氏志贺氏菌1型5型，可先用福氏多价血清做凝集试验。如果呈现凝集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型(见GB/T4789. 5-2003表2)。6.4.3.3 如按噬菌体裂解模式提示为福
16、氏6型，鲍氏各型或病疾3型12型，可先用福氏6型血清做凝集试验。福氏6型血清不凝集者，可用鲍氏多价血清或瘸疾312多价血清做凝集试验。如果呈现凝集，再分别用各型因子血清检查。6.4.3.4 如按噬菌体裂解模式提示为宋内氏E相菌而不被宋内氏血清凝集时，可直接按噬菌体裂解模式和粗糙形菌落特征判定之。6.4.3.5 按噬菌体裂解模式所提示的方向做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬菌体裂解模式不相符者，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被lRTD的Sh噬菌体裂解者，均应做葡萄糖镀试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖钱试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时还可以做如下的生化试验，即:乙酸锅、
17、克氏拧橡酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶、七叶苦的257 GB/T 4789.31-2003 分解试验，除宋内氏茵和鲍氏13型为鸟氨酸阳性、宋内氏菌的少数菌株可利用粘液酸，福氏4.型的少数菌株可利用乙酸锅外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。这些试验中任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌。6.4.3.6 检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性(见GB/T4789. 5-2003表3)，但福氏6型与A群或C群相似。青在基质阳性的志贺氏菌血清型为瘸疾2型、7型和8型，鲍氏5、7、9、11、13、15、16和17型，但福氏1型5型的自在基质反应较弱p青童基质阴性的志贺氏菌血清型为病疾1型、3
18、型6型、9型12型、福氏6型、鲍氏1型4型，6型，8型，10型，12型，14型和18型及宋内氏菌。6.5 大肠埃希氏菌肠毒素试验按GB/T4789.6进行。6.6 结果报告6. 6. 1 沙门氏菌检验的结果报告6. 6. 1. 1 0-1噬菌体裂解，其他均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告p或符合上述裂解结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。6. 6. 1. 2 各种噬菌体均不裂解，但生化试验确定为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告$或符合上述生化试验结果，但尚未做血清分型试验者，可报告为沙门氏菌未分型。6.6. 1. 3 非如上述的裂解结果，或生化试验否定为沙门氏菌者，可报告
19、为非沙门氏菌。6.6.2 志贺氏菌检验的结果报告6.6. 2. 1 Sh噬商体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式相符者，可报告志贺氏菌分型结果。罕见血清型要求被1RTD Sh噬菌体裂解，并符合志贺氏菌生化分群结果.6.6.2.2 非如上述的试验结果均报告为非志贺氏菌。6.6.3 致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告6.6. 3. 1 E和或Sh、E-4噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有同一性，经血清学分型确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌(要求有炀毒素试验结果)，侵袭性大局埃希民菌(要求赖氨酸阴性、动力阴性，但0124亦可为动力阳性)，肠道出血性大肠埃希氏菌(限于0157)或肠道致病性大肠埃希氏菌。6.6.3.2 各种噬菌体均不裂解，经生化试验符合大肠埃希氏菌，并经血清学分型确定者，亦可分别报告各类致泻大肠埃希氏菌，其要求与6.6.3.1相同。6.6.3.3 非如6.6.3.1和6.6.3.2结果均报告为非大肠埃希氏菌或非致泻大肠埃希氏菌。258
