1、GB/T 4789.34-2003 264 前言本标准的附录A、附录B是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京市卫生防疫站。本标准主要起草人g杨宝兰、冉陆、李志刚、王淑真、杨大进、贾珍珍。1 范围食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验本标准规定了双歧杆菌的检验方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789.34-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使
2、用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 双歧杆菌Bifidobacterium 一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽胞，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。3.2 双歧杆菌菌落计数enumeration of Bifidobacterium 在一定条件培养后，所得1mL(g)检样中所含双歧杆菌菌落数。4 设备和材料4.1 恒温培养箱:36C士1C。4.2 恒温水浴锅:46C土1C。4.3 显微镜:10X100
3、X。4.4 厌氧培养装置z厌氧罐、厌氧箱。4.5 离心机:3 000 r/min. 4.6 气相色谱仪(具有氢火焰检测器FID)。4. 7 架盘药物天平:0g500 g.精度。.5日。4.8 灭菌吸管:1mL(具0.01刻度)、10mL(具O.1 度)。4.9 灭菌平皿直径90mm. 4.10 广口瓶或锥形瓶:300mL、500mL。5 培养基和试剂5.1 0.85%灭菌生理盐水。5.2 TPY琼脂培养基见第A.3章。5.3 BL琼脂培养基2见第A.2章。265 GB/T 4789.34-2003 5.4 BBL琼脂培养基z见第人1章。5.5 双歧杆菌生化用基础培养基:见第A.4章。5.6 P
4、YG液体培养基:见第A.5章。5. 7 革兰氏染色液z按GB/T4789.28-2003中2.2规定。5.8 灭菌液体石蜡。5.9 甲醇-分析纯。5.10 三氯甲烧:分析纯。5.11 硫酸:分析纯。5.12 冰乙酸z分析纯。5.13 乳酸3分析纯。5.14 乙酸标准榕液吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中.加水至刻度，标定，标定方法见附录B.此溶液浓度约为1mol/L。5.15 乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/Lo 5.16 乳酸标准溶液吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此j容i夜浓度约为1mol
5、/L 5.17 乳酸标准使用液:将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/Lo 6 检验程序检验程序见图l。72h土3h生化培养观察10大圈17 操作步骤7.1 以无菌操作将充分混匀的检样25g(mL)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成GB/T 4789.34-2003 l 10的均匀稀释液。7.2 用1mL灭菌吸管吸取1 10稀释液1mL.沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，做成l100的稀释液。7.3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL 灭菌吸管。7.4 选择2个3个以上适宜稀释度，分别在作10倍
6、递增稀释的同时，各取0.1mL分别加入计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选用2种3种培养基CBL、BI丑，、TPY培养基).同时作灭菌生理盐水空白对!照。7.5 待琼脂表面于后，翻转平皿，放至厌氧罐内，操作全过程须在20min内完成。7.6 将厌养罐置36.C士rc温箱内培养72h士3h.:I.!l察双歧杆茵茵落特征见表1。选取菌落数在30300之间的平极对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性、无芽胞、着色不均匀、出现Y或V型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。培养基BL培养基为黄色BB
7、L培养基为黄色TPY 培养基为黄色表1双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征双歧杆菌特征菌落中等大小，表面光亮，边缘整齐呈瓷白色、奶油色，质地柔软、细腻菌落中等大小，表面光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、绍腻7.7 菌落计数根据证实为双歧杆菌的菌落数，计算出平皿内的双歧杆菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果。例如，检样lX10倍的稀释液在BBL琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1mL样品中双歧抨菌数为210 X 35 X 4/5 X 1
8、0 = 2.8 X 106 8 双歧杆菌菌种鉴定8.1 $化试验8. 1. 1 菌种制备=自平板上挑取菌落，接种于BL，BBL或TPY琼脂平板仁，放至厌氧罐内，于:16.C士I.C、72h土3h厌氧培养。刮取菌苔，和l备菌悬液，浓度为109cfu/mL10n cfu/mL.分别进行试验。8. 1. 2 生化鉴定试验:双歧杆菌一般不还原硝酸盐(但当培养基有溶解的红细胞时，叮以还原硝酸盐).不产被基质和硫化氢。常用双歧杆菌的碳水化合物反应见表2.常用双歧杆菌1分叉双歧忏菌(且.bilidum) Z长双歧串于1草(扫.longwn)3婴儿双歧杆菌lH. infuntis) 正7届京百存百一一(B.
9、reve) 5青春双歧忏菌(B. adolescentis) 表2双歧杆菌属内种的鉴别要点.核糖IL阿拉伯糖|乳糖|纤维二糖|松三糖|棉子糖|山梨醇+ 卡一十十注，d表示有些菌株阳性，有些菌株阴性。267 GBjT 4789.34-2003 8.2 气相色谱法分析双歧杆菌的有机戳代谢产物自平板上挑取菌落，接种于PYG液体培养基，厌氧36C:c1C、72h士3h培养，取除菌上清液分析双歧杆菌的有机酸代谢产物。双歧杆菌分解葡萄糖，生成乙酸和乳酸，形成比约3: 2，样品经酸化、离心后，上清液直接进气相色谱仪测定其中的乙酸。样品经硫酸甲醇甲醋化，以三氯甲烧提取，取三氯甲烧层进气相色谱仪测定其中的乳酸。
10、8.2.1 分析步骤8.2. 1. 1 样晶处理8.2. 1.1. 1 乙酸测定:取除菌上清液2mL3 mL，JJ日人体积分数为50%硫酸。1mL.混匀4000 r/min 离心5min，吸取上清液分析。8. 2. 1. 1. 2 乳酸测定:取除菌上清液2mL3 mL.放人10mL比色管中.100C水浴10min，加入体积分数为50%硫酸0.2mL.甲醇1mL.58C水浴30min后加水1mL，加三氯甲烧0.5mL.振摇3mn , 3 000 r/min离心5min，取三氯甲炕层分析。8.2. 1. 2 测定8.2. 1. 2. 1 气相色谱仪参考条件8.2. 1. 2. 1. 1 色谱柱z内
11、径3.2mm，长2m的不锈钢柱，内装涂以30g/L磷酸的60目80日GDX-401。8.2. 1. 2. 1. 2 氢火焰检测器(FJD):气化室、检测器温度:200C ;氮气流速:60mL/min;氢气流速255 mL/min;空气流速:600mL/min;纸速:0.5mm/min, 8.2. 1. 2. 3 根据保留时间定性，外标法定量。计算见式(1): x=手.(1 ) 式中gX一一样品中有机酸的含量，单位为微摩尔每毫升(mol/mL); A一-被测定样液中有机酸的含量，单位为微摩尔(mol);V 样晶体积，单位为毫升(mL)。结果的表述2报告平行测定的算术平均值的两位有效数。8.2.
12、1. 2. 4 色谱图见图2，IL L 己醺乳酸固28. 2. 1. 2. 5 允许差:相对相差;15%。8.2.2 最低检出浓度一一乙酸为0.6mol/mL;一一乳酸为0.8mol/mL。268 A.l BBL琼脂培养基A. 1. 1 成分蛋白陈酵母粉葡萄糖可溶性淀粉氯化纳5%半脱氨酸西红柿浸出液吐温-80肝提取液琼脂蒸馆水pH7.0士O.1 A. 1. 2和l法附录A(规范性附录)专用培养基及试剂15.0 g 2.0 g 20.0 g 0.5 g 5.0 g 10.0 mL 400.0 mL 1. 0 mL 80.0 mL 20.0 g 520.0 mL GB/T 4789.34-2003
13、 A. 1. 2.1 西红柿浸出液的制备=将新鲜西红柿洗净称重后切碎，加等量蒸馆水在100C水楼中加热，时时搅拌，约90min，然后用绒布过滤，校正pH7.0，分装锥形瓶，1l50C高压灭菌15min-20 mino A. 1. 2. 2 肝提取液的制备z称取新鲜猪肝1000 g，切成小块或绞碎，加蒸馆水至2000mL，混匀，置冰箱中过夜。第三天煮沸15mn-20 mn，绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。分装锥形瓶。A. 1. 2. 3 按A.1.1成分配制，校正pH7.0，分装锥形瓶，1l5C高压灭菌15min-20 min。A.2 BL琼H培养基A.2.1 成分蛋白且在5.0 g
14、 膜陈5.0 g 植物陈3.0 g 酵母粉2.0 g 葡萄糖10.0 g 可溶性淀粉0.5 g 牛肉膏3.0 g 吐温-801. 0 mL A液10.0 mL B液5.0 mL 肝提取液150.0 mL 琼脂20.0 g 5%半脱氨酸10.0 mL 269 GB/T 4789.34-2003 蒸馆水pH7.2士O.1 A.2.2 制法840.0 mL A.2.2.1 A液的制备z称取磷酸二氢饵10g.磷酸氢二掷10g.加蒸馆水至100mL.混匀.1l5C高压灭菌15min-20 min。A. 2. 2. 2 B液的制备称取硫酸筷10g.硫酸亚铁0.5g.氯化锅0.5g.硫酸锺0.337g.加蒸
15、馆水至250 mL.混匀.1l5C高压灭菌15min-20 mino A. 2. 2. 3 按A.2.1成分配制，校正pH7.2.分装锥形瓶.1l5C高压灭菌15min20 min。A.3 TPY琼Ii培养基A. 3.1 成分水解酷蛋白植物陈酵母粉葡萄糖5%半脱氨酸磷酸氢二梆(K2HPO.)氯化续(MgC12 6H2) 硫酸铮(ZnSO，.7H2) 氯化钙(CaC12)氯化铁(FeC13)吐温80琼脂蒸馆水pH6.5士0.1A.3.2 制法10.0 g 5.0 g 2.0 g 5.0 g 10.0 mL 2.0 g 0.5 g 0.25 g 0.15 g 微量1. 0 mL 20.0 g 1
16、000.0 mL 将A.3.1成分加热溶解、校正至pH6.5土O.，分装锥形瓶.1l5C高压灭菌15min,._ 20 min A.4 双歧杆菌生化用基础培养基A.4.1 成分蛋白陈膜脐、吐温-80溶液BL半脱氨酸1. 6%澳甲盼紫10.0 g 5.0 g 1. 0 mL 5.0 mL 0.2 g 1. 4 mL 琼脂1. 5 g pH7.2士。1A. 4. 1. 1 B液称取硫酸续10g.硫酸亚铁0.05g.氯化锅。.5g.硫酸锺0.337g.加蒸馆水至250mL。A. 4. 1. 2 用于糖分解试验的培养基配制:将基础培养基成分(除指示剂溶液外)溶解后，调pH至7.2士0.1.再加指示剂溶
17、液。糖的种类按0.5%加入(七叶背为0.25%).分装小试管，每管3mL, 115C高压灭菌20min。生化试验必须设无糖对照管，每管接种菌悬液0.05mL.直接接种到培养基的底部。因双歧杆菌是270 GB/T 4789.34-2003 专性厌氧，所以要在培养基上面盖上-层液体石蜡(0.8m L) 0 370C培养7d10 d o A. 4. 2 观察结果第4天和第10天两次观察糖分解性能。以培养基中的指示剂变色情况判定:微黄色为士，部分变黄者为十，全部变黄者微透明为十，全部变黄且菌发育明显呈混浊者为+十。A.5 PYG液体培养基A.5.1 成分蛋白陈葡萄糖酵母膏盐酸半脱氨酸盐溶液维生素K，溶
18、液氯化血红素溶液5rng/mL 蒸馆水pH7.2土0.110.0 g 2.5 g 5.0 g 0.25 g 20.0 mL 0.5 mL 2.5 mL 500.0 mL A. 5. 1. 1 盐溶液的配制z称取无水氯化钙0.2g，硫酸筷0.2g，磷酸氢二梆1臣，磷酸工氢梆1g，碳酸氢例10g，氯化纳2g，J日蒸馆水至1000 mLo A. 5. 1. 2 氯化血红素榕液(5mg/mLl的配制:称取氯化血红素0.5g溶于1mol!L氢氧化纳1rnL 中，加蒸馆水至100mL, 121 oC高压灭菌15min，冰箱保存。A. 5. 1. 3 维生素K，溶液的配$J:称取维生素K，1 g加元水乙醇9
19、9mL，过滤除菌，放冷暗处保存。A. 5. 1. 4 制法:将A.5. 1成分混合加热溶解，冷后调pH至7.2，加热10min，过滤，1210C高压灭菌15 min。271 GB/T 4789.34-2003 附录B(规范性附录)标准溶液的标定B.1 乙酸的标定2准确称取乙酸3g，加水15mL，盼lIt指示液两滴，用1mol/L氢氧化销溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1 mol/L氢氧化纳溶液相当于60.05mg的乙酸CCzH.Oz)。B.2 乳酸的标定z准确称取乳酸1g，加水50mL，精密加人氢氧化纳滴定液(1mol汀，)25mL，煮沸5 min，加入盼歌指示液两滴，趁热用0.5mol/L硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1 mL 1 mol/L氢氧化纳滴定液相当于90.08mg的乳酸CC3H，03)。272
