1、GB/T 4789.35-2003 . 目。古生FE司本标准对GB/T16347-1996(乳酸菌饮料中乳酸菌微生物学检验进行修订。本标准与GB/T16347一1996相比主要修改如下:一一按照GB/T1. 12000对标准文本的格式和文字进行修改。一一修改和规范原标准方法中的设备和材料本标准自实施之日起，GB即/丁T、16347-1996同时废止。本标准的附录A是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位2南京市卫生防疫站、广东省食品卫生监督检验所、上海市食品卫生监督检验所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。274 本标准主要起草人=陈晓蔚、刘敏、杨明、朱曼丹、瞿
2、明娟、周蓓君、杨宝兰、李志刚。原标准于1996年首次发布，GB/T4789. 35-2003代替GB/T16347-1996 , 1 范围食晶卫生微生物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。GB/T 4789.35-2003 本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用
3、文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.1 食品卫生微生物学检验方法总则GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验方法染色法、培养基和试剂3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 乳酸菌lactic acid bacteria 一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的元芽胞杆菌和球菌。3.2 乳酸菌菌落总蚊lactic acid aerobic bacteria 检祥在一定条件下培养后，所得1mL(g)检样中所含乳酸菌菌落的总数。4 设备和材料4. 1 冰箱。C4C。4.2 恒温培养箱，36C土1C。4.3 恒温水浴锅，4
4、6C士I04.4 显微镜z10100。4.5 均质器或灭菌乳钵。4.6 架盘药物天平，0g500 g.精确至0.5g。4.7 锥形瓶500mL。4.8 广口瓶，500mL。4.9 灭菌吸管，1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。4. 10 灭菌平皿2直径90mm。4. 11 灭菌刀、剪、慑子。5 培养基和试剂5. 1 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)。275 GB/T 4789.35-2003 5.2 改良MC培养基(ModifiedChalmers培养基)。5. 3 o. 1 %美蓝牛乳培养基。5. 4 6. 5 %氯化销肉汤。5.5 pH9.6葡萄糖肉汤。5.
5、6 40 %胆汁肉汤。5. 7淀粉水解培养基见第人7章。5.8 精氨酸水解培养基见第A.8章。5.9 七叶背培养基见第A.I0章。5. 10 革兰氏染色液:按GB/T4789. 28规定。5. 11 3 %过氧化氢溶液z按GB/T4789. 28规定。5. 12 蛋白陈水、能基质试弗，按GB/T4789.28规定。5. 13 明胶培养基:按GB/T4789. 28规定。5. 14 硝酸盐培养基、硝酸盐试JJ，按GB/T4789. 28规定。5.15 0.85%灭菌生理盐水。6 乳酸菌菌落总数的测定6. 1 检验程序乳酸菌菌落总数检验程序见图1, 检样作成几个适当倍量的辅罪被选择2个-3个适当稀
6、，李蓝各以1mL加入灭菌培#皿内每皿内如入适量ill良TJA或改良MC培养基36C士1C172h士3h菌蕾计量报告图16.2 操作步骤6. 2. 1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1 10的均匀稀释液。6.2.2 用lmL灭菌吸管吸取1 10稀释液lmL，沿管壁徐徐注人含有灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀。6. 2. 3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL 灭菌吸管。6.2.4 选择2个3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即
7、以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。276 GB/T 4789.35-2003 6.2.5 稀释液移人平皿后，应及时将冷至50C的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL.并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结果须在20min内完成。6.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36C士lC温箱内培养72h士3h.观察乳酸菌菌落特征(见表1)，选取菌落数在30300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取五个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并
8、做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，元芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10-的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取五个鉴定，证实为乳酸菌的是四个，则1mL检样中乳酸菌数为235X4/5X10=2.8X10 6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1.表1乳酸菌在不同培养基上菌落特征改良TJA改良MC杆菌平皿底为黄色，菌落中等大小，徽白色，湿润，平皿底为粉红色，菌落较小，国形.红色，边缘边缘不整齐，直径3mm土1mm，:(tl棉絮团状菌落似星状，直径
9、2mm士1mm，叮有淡淡的晕球菌平皿底为黄色，菌落光滑，湿润微白色，边缘平皿底为粉红色，菌落较小，圆形.红色，边缘整齐整齐，可有淡淡的晕注2干酷乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状。7 乳酸菌的鉴定对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，作以下试验27. 1 菌种制备2自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36C+ lC , 24 h48 h 培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。7.2 乳酸杆菌鉴定试验:极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生青童基质和硫化氢。7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2，表2常见乳杆菌属内神的碳水化合物反应七叶昔纤维二糖
10、麦芽糖甘露醇水杨昔山梨醇干酷乳杆菌+ + d 十+ 十干酶亚种保加利亚乳杆菌嗜酸乳杆菌+ 十+ 十乳酸乳杆菌# 十注，d有些菌株阳性，有些菌株阴性p笠弱、慢或阴性。7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3，表3产乳酸的链球菌的鉴别表生长试验0.1% 6.5% 40% 加热水解pH lOC 45C 60( 美蓝牛乳氯化铀胆汁9.6 淀粉30 min 嗜热链球菌+ + 斗牛乳链球菌+ + 十d 乳脂链球菌+ d 十d 注:d有些菌株阳性，有些菌株阴性。i.1!;糖d + 十水解精氨酸+ 277 G/T 4789.35-2003 附录A(规范性附录)专用培养基及试剂A. 1 改良番茄汁琼脂培养基(改
11、良TJA培养基)A. 1. 1 成分番茄汁酵母抽提液牛肉膏乳糖葡萄糖磷酸氢二饵(几HPO.)吐温80乙酸纳琼脂蒸馆水pH6.8士O.2 A. 1. 2 制法50 mL 5 g 10 g 20日2 g 2 g 1 g 5日15 g 加至1000 mL 番茄汁的制作:将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎).放入锥形瓶，置4(;冰箱8h12 h.取出后用纱布过滤。如一次使用不完，可将其置人。冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。审j法=将所有成分加入蒸馆水中.加热溶解，校正pH6.8土O.2。分装，高压灭菌121C15 min 20 mn。临用时加热熔化琼脂，冷至50C时使用。A.2 改良MC培
12、养基A. 2. 1 成分大豆蛋白陈5 g 牛肉浸膏5 g 酵母浸膏5 g 葡萄糖20 g 乳糖20 g 碳酸钙10 g 琼脂15 g 蒸馆水1 000 mL 1%中性红溶液5 mL 硫酸多粘菌素以酌情而加)10万IUA. 2. 2 制法z将前面七种成分加入蒸馆水中，加热溶解，校正pH6.加入中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌121C15min20 min. r陆用时加热溶化琼脂，冷至50C.酌情加或不加硫酸多粘菌素B(检样有胖听或开罐后有异味等疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B.昆匀后使用)。A.3 O. 1 %美蓝牛乳培养基新鲜脱脂牛乳90 mL 278 1%美蓝水溶液A.4 6.5%氯化铀肉汤肉浸
13、膏(pH7.6)氧化纳A.5 pH9.6葡萄糖肉汤lOmL 100 mL 6 g 普通肉汤校正pH9.6加入。.2%葡萄糖A.6 40%胆汁肉汤 H 7. G肉浸液葡萄糖牛腕汁A. 7 淀粉水解培养基pH . 6肉浸液琼脂1血清60 mL O. 12 g 40 mL 90 mL 5 mL :l9/淀粉溶液10 mL GB/T 4789.35-2003 将肉泛液琼脂洛化.1于冷至50.C左右以无菌操作加入淀粉溶液及元商羊血清混合后，倾注平扳。A.8 精氨酸水解培养基蛋白陈氯化纳磷酸氢二御L-精氨酸1.6%澳叶1!li紫乙醇j容液EfBR 蒸f宵水pH7. :2 A.9 乳酸杆菌糖发酵曹A. 9. 1 1幸树成分牛肉膏蛋白陈酵砾没啻R吐;jhl-8041脂1.6%澳甲盼紫乙醇溶液蒸馆水。Ig0.5 g 0.6 g 1 g 1. 4 mL 0.3 g 100 mL g 。E5 g 0.5 mL 1.5日1. 4 mL 1 000 m l. A.92 按0.5%加入所需糖类，并分装小试管。也10七叶昔培养基蛋白陈5 g 279
