1、ICS 07.100.30 C 53 中华人民共和国国家标准2008-11-21发布G/T 4789.40-2008 食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验Microbiological examination of food hygiene一Examination of Enterobacter sakazakii 中华人民共和国卫生部q:7i: 中国国家标准化管理委员会Q(.IJ 2009-03-01实施中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验GB/T 4789. 40一2008* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394
2、668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销苦开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数17千字2009年3月第一版2009年3月第一次印刷* 书号:155066 1-36036定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533G/T 4789.40-2008 目。吕本标准的第一法修改采用国际标准化组织(ISO)ISO/TS 22964: 2006 (乳和乳制品中阪崎肠杆菌( Milk and milk products-Detection of Enterobacter sakzakii)的检验方法，第二法参考美
3、国食品药品管理局(FDA)(婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和计数)lsolationand enumeration of Enterobacter sakazakii from dehydrated powdered infant formula(J uly 2002门的检验方法。本标准与ISO方法的区别如下:一培养温度由37oc土1oc改为36oc土1oC; 一一阪崎肠杆菌选择性分离平板由ESIA改为DFI，培养温度由440C士1oC改为36oC士1oC; 一一第一法中确定100g(或100mL)为基本检测单位;一一增加了第二法，作为阪崎肠杆菌检测的MPN定量检测方法。本标准的附录A、附录B为
4、规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人:刘秀梅、裴晓燕、郭云昌。I GB/T 4789.40-2008 1 范围食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验本标准规定了食品中阪崎肠杆菌的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下22. 1 恒温培养箱:25oc士1oC , 36 oC士1oC 44 oC士0.5oC。2.2 冰箱:2 oC J 5 c。2.3 恒温水浴箱:44oC :
5、1: 0. 5 oC。2.4 天平:感量0.1go 2.5 均质器。2.6 振荡器。2. 7 元菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8 元菌锥形瓶=容量100mL、200mL、2000 mLo 2.9 元菌培养皿:直径90mm。2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.11 VITEK全自动微生物鉴定系统1)。3 培养基和试剂3. 1 缓冲蛋白陈水(bufferpeptone water,BPW) :见第A.1章。3.2 改良月桂基硫酸盐膜蛋白陈肉汤-万古霉素(modifiedlauryl sulfate tryptose broth
6、-vancomycin medium,mLST-Vm) :见第A.2章。3.3 阪崎肠杆菌显色培养基(druggan-forsythe-iversen，DFl) 2)琼脂:见第A.3章。3.4 膜蛋白陈大豆琼脂(trypticasesoy agar, TSA) :见第A.4章。3.5 API20E生化鉴定试剂盒1)。3.6 氧化酶试剂:见第A.5章。3.7 L-赖氨酸脱竣酶培养基:见第A.6章。3.8 L-鸟氨酸脱竣酶培养基z见第A.7章。3.9 L-精氨酸双水解酶培养基z见第A.8章。3. 10 糖类发酵培养基z见第A.9章。3. 11 西蒙氏拧棱酸盐培养基:见第A.10章。1) 由法国生物
7、梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2) 由英国Oxoid公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1 GB/T 4789.40-2008 4 检验程序检验程序见图105 操作步骤5. 1 前增菌和增菌第一法阪崎肠杆菌的检验检样100g (或100mL) +BPW稀释液900mL 36 c士1C, 18 h士2h 1 mL+mLST-Vm 10 mL 44 c士0.5C, 24 h士2
8、hDFI琼脂图1阪崎肠杆菌检验程序取检样100g(或100mL)加入已预热至440C装有900mL缓冲蛋白陈水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36oC士1oC培养18h土2h。移取1mL转种于10mL mLST-Vm肉汤，44oC 土0.5oC培养24h士2h。5.2 分离5.2. 1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个DFI平板，36oC 士1oC培养24h土2h。5.2.2 挑取1个-5个可疑菌落(直径约1mm-J 3 mm的蓝绿色菌落)，划线接种于TSA平板。25oC :1: 1 oC培养48h土4h。 GB/T 4789.40-2008 5.
9、3 鉴定自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。可选择API20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。表1阪崎肠杆菌的主要生化特征生化试验特征黄色素产生十氧化酶L-赖氨酸脱竣酶L-鸟氨酸脱竣酶(十L-精氨酸双水解酶十拧攘酸水解(+) D-山梨醇(一)L-鼠李糖+ 发酵D-蔚糖十D-蜜二糖十苦杏仁试+ 注十99%阳性;一99%阴性;(十)90%99%阳性;()90%99%阴性。5.4 阪崎肠杆菌的报告综合菌落形态和生化特征，报告每100g(或100mL)样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。第二法阪崎肠杆菌的计数6 操作步骤6. 1 样
10、品的稀释6. 1. 1 固体和半固体样品:元菌称取样品100g、10g、1g各三份，加入已预热至44oC分别盛有900 mL、90mL、9mL BPW中，轻轻振摇使充分溶解，制成1: 10样品匀液，置36oC士1oC培养18h 士2ho分别移取1mL转种于10mL mLST-Vm肉汤，440C士0.50C培养24h士2ho 6.1.2 液体样品:以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份，加入已预热至44oC分别盛有900 mL、90mL、9mL BPW中，轻轻振摇使充分混匀，制成1: 10样品匀液，置36oC士1oC培养18h 土2h。分别移取1mL转种于10mL mLST-Vm
11、肉汤，440C士0.50C培养24h士2h。6.2 分离、鉴定同5.25.306.3 阪崎肠杆菌计数的报告综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g(或100 mL)样品中阪崎肠杆菌的MPN值(见表B.1)。3 GB/T 4789.40-2008 附录A(规范性附录)培养基和试剂A.1 缓冲蛋白陈水(BPW)A. 1. 1 成分蛋白陈氯化纳磷酸氢二销(Na2HP04 12H20) 磷酸二氢饵蒸馆水pH 7.2 A. 1.2 制法加热搅拌至溶解，调节pH，121oc高压灭菌15mino 10 g 5 g 9 g 1. 5g 1 000 mL A.2 改
12、良月桂基硫酸盐肢蛋白陈肉汤田万古霉素(modifiedlauryl sulfate tryptose broth-vancomycin me dium,mLST-Vm) 汤肉T QU L m 陈白H蛋膜盐酸蹦蹦腊分铮铮翩良成陈氢二基改销自二氢烧水1化，蛋糖酸酸二馆11氯膜乳磷磷十蒸呵，ndAA 34.0 g 20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 0.1 g 1 000 mL pH 6.8士0.2A. 2. 1. 2 制法加热搅拌至溶解，调节pH。分装每管10mL, 121 oc高压灭菌15min。A.2.2 万古霉素溶液A. 2. 2.1 成分万古霉素蒸馆水10.0 mg 10
13、.0 mL A.2.2.2 制法10.0 mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馆水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在ooC ,_, 5 oC保存15夭。A. 2. 3 改良月桂基硫酸盐膜蛋白陈肉汤m万古霉素(modifiedlauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium,mLST-Vm) 每10mL mLST加入万古霉素溶液0.1mL，混合液中万古霉素的终浓度为10g/mLo注意:mLST-Vm必须在24h之内使用。4 A.3 阪崎肠杆菌显色培养基(DFI琼脂)A.3.1 成分膜蛋白陈大豆蛋白陈氯化铀拧橡酸铁钱硫代硫酸铀脱氧胆酸销5-澳-4-氯-3-月|
14、味-D-毗喃葡糖试琼脂蒸馆水pH 7.3士0.2A.3.2 制法15.0 g 5.0 g 5.0 g 1. 0g 1. 0g 1. 0g 0.1 g 15 g 1 000 mL 加热搅拌至完全溶解，调节pH，1210C高压15min，冷却至50oC，倾注平板。A.4 膜蛋白陈大豆琼脂(TSA)A. 4.1 成分膜蛋白陈植物蛋白陈氯化销琼脂蒸馆水pH 7.3士0.2A.4.2 制法15.0 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 1 000 mL 加热搅拌至溶解，煮沸1min，调节pH，121oC高压15mino A.5 氧化酶试剂A.5.1 成分N ,N ,N ，N-四甲基对苯二胶盐酸盐蒸馆
15、水A.5.2 制法少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.5.3 试验方法1. 0g 100.0 mL GB/T 4789.40-2008 用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注意:实验中切勿使用镰/铭材料。A.6 L-赖氨酸脱竣酶培养基A.6.1 成分L-赖氨酸盐酸盐(L-lysinemonohydrochloride) 5.0 g 酵母浸膏3.0 g 葡萄糖1. 0g 5 GB/T 4789.40-2008 澳甲盼紫蒸馆水A.6.2 制法0.015
16、 g 1 000 mL 将各成分加热溶解，必要时调节pH，使之在灭菌后25oC pH值为6.8士o.2。每管分装5mL , 121 oC高压15mino A.6.3 实验方法挑取培养物接种于L-赖氨酸脱竣酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30oC士1oC培养24h 士2h，观察结果。L-赖氨酸脱竣酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.7 L-鸟氨酸脱竣酶培养基A. 7.1 成分L-鸟氨酸盐酸盐CL-ornithinemonohydrochloride) 酵母浸膏葡萄糖澳甲盼紫蒸馆水A.7.2 制法5.0 g 3.0 g 1. 0g 0.015 g 1 000 mL 将各成分加热溶解，
17、必要时调节pH，使之在灭菌后25oC pH值为6.8士O.2。每管分装5mL。121 oC高压15min。A.7.3 实验方法挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱竣酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30oC :i: 1 oC培养24h 士2h，观察结果。L-鸟氨酸脱竣酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.8 L-精氨酸双水解酶培养基A. 8.1 成分L-精氨酸盐酸盐CL-arginine monohydrochloride) 酵母浸膏葡萄糖澳甲盼紫蒸馆水A.8.2 制法5.0 g 3.0 g 1. 0g 0.015 g 1 000 mL 将各成分加热溶解，必要时调节pH，使之在灭菌后25oC
18、 pH值为6.8士O.2。每管分装5mL。121 oC高压15min。A. 8. 3 实验方法挑取培养物接种于L-精氨酸脱竣酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30oC士1oC培养24h 土2h，观察结果。L-精氨酸脱竣酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。A.9 糖类发酵培养基A. 9.1 基础培养基A. 9.1.1 成分6 酷蛋白酶消化氯化纳盼红10 g 5 g 0.02 g GB/T 4789.40-2008 蒸馆水1 000 mL A. 9. 1. 2 制法将各成分加热溶解，必要时调节pH，使之在灭菌后250CpH值为6.80每管分装5mLo 121 oC高压15min A.9.2
19、 糖类溶液(-山梨醇、L-鼠李糖、B震糖、b蜜二糖、苦杏仁试)A. 9. 2.1 成分糖8 g 蒸馆水100 mL A.9.2.2 制法分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D蕉糖、D蜜二糖、苦杏仁试等糖类成分各8g，溶于100mL蒸馆水中，过滤除菌，制成80mg/mL的糖类溶液。A.9.3 完全培养基A. 9.3.1 成分基础培养基糖类溶液A. 9.3. 2 制法875 mL 125 mL 无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混匀;分装到元菌试管中，每管10mLo A.9.4 实验方法挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30oC士1oc培养24h 士2h，观察结果。糖
20、类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。A.10 西蒙氏拧攘酸盐培养基A. 10. 1 成分拧棱酸纳氯化销磷酸氢二饵磷酸二氢镀硫酸续澳百里香盼蓝琼脂蒸馆水A. 10.2 制法2.0 g 5.0 g 1. 0g 1. 0g 0.2 g 0.08 g 8.0 g_18. 0 g 1 000 mL 将各成分加热溶解，必要时调节pH，使之在灭菌后25oC pH值为6.8士0.2。每管分装10mL, 121 oC高压15min，制成斜面。A. 10.3 实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面，36oC士1oC培养24h士2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。OON|.gh叮vH筒。GB/T 478
21、9.40-2008 附录(规范性附录)阪崎肠杆菌最可能数(MPN)检索表B 每100g(或100mL)检样中阪崎肠杆菌最可能数(MPN)的检索见表B.1。表B.1 阪崎肠杆菌最可能数(MPN)检索表阳性管数95%可信限阳性管数95%可信限MPN MPN 100 10 1 下限上限100 10 1 下限上限。110 42 注1:本表采用3个检样量100g(或100mL)、10g(或10mL)和1g(或1mL门，每个检样量接种3管。注2:表内所列检样量如改用1000 g(或1000 mL)、10g(或10mL)和1g(或1mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改用10g(或10mL)、1g(或1mL)和0.1g(或0.1mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。侵权必究书号:155066 1-36036 定价z14.00元 版权专有GB/T 4789.40-2008
