1、k才己|中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0751-1999 出口食品中嗜水气单胞菌检验方法Method for determination of Aeromonas hydrophila in f ood f or export 1999- 05 -05发布1999 - 08 -01实施中华人民共和国国家出入境检验检疫局发布SN/T 0751-1999 前本标准是根据GB/T1. 1-1993(标准化工作导则第1单元:标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定及SN/T0001-1995(出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定的要求进行编写的。其中检
2、验方法是参考了国内外有关资料及伯杰细菌鉴定手册)(第一卷)(1984年第八版)弧菌科内容，在进行实验的基础上编写而成。本标准同时制定了抽样和制样方法。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国国家出入境检验检疫局提出并归口。本标准由中国进出口商品检验技术研究所、中华人民共和国烟台商品检验局负责起草。本标准主要起草人:孟洪德、董克难、王静。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中嗜水气单胞菌检验方法SN/T 0751-1999 1 范围Method for determintion of Aeromonas hydrophila in food for expor
3、t 本标准规定了出口食品中嗜水气单胞菌的检验方法。本标准适用于出口水产品、罐头食品和小食品中的嗜水气单胞菌的检验。2 抽样和制样2. 1 检验批以不超过2500件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量(见表1)表1批量，件最低抽样数，件125 1 26100 5 101250 10 251500 15 5011 000 17 10012500 20 2. 3 抽样方法按表1规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。从每件中取一袋作为原始样品。原始样品总量不少于Z kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。如每件中无小包装，或有小包
4、装但每袋质量超过2kg者，则可用灭菌锋利刀在抽出的包件中，每件割取不少于100g。泪合后置于清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的总量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。2.4 试样制备从所取原始样品中取出有代表性样品约1kg，充分绞碎，混匀，均分成两份。分别装入清洁容器内作为试样，加封后，标明标记。2.5 试样保存将试样于18C以下冷冻保存。注:在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染。3 测定方法3. 1 设备和材料中华人民共和国国家出人境检验检擅局1999- 05 -05批准1999- 08-01实施1 3. 1. 1 天平:称量2kg。3. 1.2 均质器或乳钵。3
5、. 1. 3 温箱:36C:f:1C。3. 1.4 显微镜。3. 1. 5 灭菌广口瓶:500mL。3.1.6 灭菌三角烧瓶:500mL , 250 mL。3. 1. 7 灭菌吸管:10mL , l mL。3. 1. 8 灭菌平皿:90mm , 15 mm。3. 1. 9 灭菌小试管:5mm ,5 cm o 3.1.10 灭菌毛细管。3. 1.11 橡皮乳头。3.1.12 载玻片。3. 1. 13 酒精灯。3. 1- 14 灭菌金属匙或玻璃棒。3. 1.15 接种棒、镇锚丝。3. 1- 16 试管架。3.2 培养基和试剂3. 2. 1 碱性蛋白脏水。3. 2. 2 氨节青霉素麦康琼脂。3.2.
6、3 三糖铁琼脂。SN/T 0751-1999 3. 2. 4 甘露醇、肌醇、七叶昔、水杨素、拧穰酸盐、阿拉伯糖发酵试验培养基。3.2.5 氧化酶试剂。3. 2. 6 粘丝试验试剂。3. 2. 7 革兰氏染色液。3.2.8 嗜盐性试验试剂。3. 3 检验步骤3. 3. 1 增菌液体食品:用无菌吸管取25mL样品加入到装有225mL 1%氧化纳APW(碱性蛋白陈水)500mL 广口瓶中。迅速振摇，充分海匀。固体食品(水产品、禽类制品):以无菌操作取25g样品入装有225mL 1%氧化纳APW中，以8 000 r/min均质12min。在36C:f: 1 C的温度中增菌培养，约在68h有轻度?昆烛时
7、，终止培养。3. 3. 2 分离培养在1%氯化铀APW中，用一个3mm接种环混匀并在氨书青霉素麦康凯琼脂中划线，于36C:f: 1 C 培养平板1824h。嗜水气单胞菌在琼脂上可出现乳白色的菌落。3. 3. 3 推定试验将可疑菌落接种到以下培养基中:三糖铁琼脂上，0%、3%和6%氯化铀蛋白陈水中，肌醇和甘露醇肉汤中，于36C:f: 1 C培养1824h。作革兰氏染色，观察是否纯菌和典型的菌体形态。细胞色素氧化酶试验:挑取菌落涂在无菌滤纸上，滴加氧化酶试剂。阳性者则在接触点出现暗红色物质。粘丝试验:在无菌载玻片上滴加一滴粘丝试验试剂，用接种环从平板上挑取一个典型菌落在试剂中研磨。能拉出长丝者为阳
8、性，否则为阴性。疑似气单胞菌者(符合所述的特征)应当作进一步试验。3. 3. 4 证实试验2 SN/T 0751-1999 将可疑菌落接种到下述发酵试验培养基中:甘露醇、肌醇、七叶营、水杨素、拧穰酸盐、阿拉伯糖等，于360C士lOC培养1824h。嗜水气单胞菌包括以下基本特征:(见附录A表Al和表A2)a)形态:革兰氏阴性，杆状，无英膜，不产生芽胞。b)在TSI斜面上的反应:碱性或酸性斜面，底部酸性，不产气，硫化氢阴性。c)细胞色素氧化酶试验:阳性。d)粘丝试验:阴性。e)甘露醇发酵:阳性。f)肌醇发酵z阴性。g)嗜盐性试验:0%、3%氧化纳脏水中生长良好，而在6%氯化制脏水中不生长。h)七叶
9、昔、水杨素、阿拉伯糖发酵:阳性。i)拧攘酸盐发酵z阴性。3 4 项目鞭毛产气氧化酶粘丝试验甘露醇肌醇0%氯化纳陈水3%氯化纳陈水6%氯化纳陈水SN/T 0751-1999 附录A(标准的附录)嗜水气单胞菌特征表Al弧菌科四个属的主要鉴别特征弧菌属发光杆菌属气单胞菌属单极毛单极毛单极毛+ 十1+ v 十+ 十+ v + 十+ 十+ + 注:豚鼠气单胞菌不产气。V:表示不定。表A2气单胞菌属三个种的鉴别要点项曰嗜水气单胞菌温和气单胞菌TSI琼脂斜面黄、红黄、红高层黄黄气体+ + 硫化氢水杨素十拧橡酸盐七叶昔+ 阿拉伯糖+ 注:黄一一产碱，黄色;红产酸，红色。邻单胞菌属多极毛+ 十十十豚鼠气单胞菌黄
10、、红黄十十十+ SN/T 0751-1999 , 附录(标准的附录)出口食品中嗜水气单胞菌检验程序B 样品25g+1%氯化纳碱性蛋白陈水225mL68h 36C:!:lC 氮节青霉素麦康凯琼脂三糖铁琼脂1824h 内内用白巾阳lulu川山山小门11111内山白山川111川白山川山山川白白内111111川川咱川1111136C:!:lC 1824h 36C土lC其他生化试验一l 报告| 附录(标准的附录)培养基和试剂C 5 碱性蛋白陈水(APW)C1.1 成分氯化饷:10.0g; C1 多价蛋白陈10.0 g; 蒸馆水:1000mL。C1.2 制备SN/T 0751-1999 将C1.1中各成分
11、在蒸锢水中加热溶解后，调节pH为8.6。将配制好的培养基分别装入三角瓶后，在121C高压灭菌15mno C2 氨韦青霉素麦康凯琼脂C2.1 成分蛋白陈:17 g; 示胖、:3g; 猪胆盐(或牛、羊胆盐):5 g; 氧化铀:5g; 琼脂:17 g; 蒸馆水:1 000 mL; 乳糖:10g; 0.01 %结晶紫水榕液:10mL; 0.5%中性红水榕液:5mL。C2.2 制备将蛋白脏、脏、胆盐和氯化铀榕解于400mL蒸锢水中，校正pH7.20将琼脂加入600mL蒸馆水中，加热海解。将两液合并，分装于烧瓶内，121C高压灭菌15mn备用。临用时加热洛化琼脂，趁热加入乳糖，冷至5055C时，加入结晶紫
12、和中性红水溶液，并加入氨节青霉素至终浓度为20g/mL。C3 三糖铁琼脂CTSI)C3. 1 成分蛋白陈:20g; 牛肉膏:5g; 乳糖:10 g; 煎糖:10 g; 葡萄糖:1 g; 氯化铀:5g; 硫酸亚铁镀:0.2g; 硫代硫酸纳:0.2g; 琼脂:12 g; 盼红:0.025g; 蒸馆水:1 000 mL。pH7.4 C3.2 制备将除琼脂和酣红以外的各成分溶解于蒸馆水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酣红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管。121C高压灭菌15mn。放置高层斜面备用。C4 氧化酶试验C4.1 试剂6 SN/T 0751-1999 :i%盐酸二甲
13、基对苯二胶榕液:少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。1%-荼酣乙醇洛液。C4.2 试验方法取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二肢溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深;再加荼酣溶液滴，阳性者于30s内呈现鲜蓝色。阴性于2min内不变色。C5 粘丝试验C5.1 试剂0.5%去氧胆酸纳水溶液。C5.2 操作方法在玻片或平皿上，滴一大滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物放在试剂旁研磨混匀，制成浓厚悬液。阳性者很快(1min内)由混变清并变得粘稠，用接种环挑取时，可以拉出细丝来。阴性者呈均匀悬液状态，与蒸情水对照相同。C6 革兰氏染色液C6.1 结晶紫染色液结晶紫:1g; 95%乙醇:20mL;
14、 1%草酸接水搭液:80mL。将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液?昆合。C6.2 革兰氏腆液腆:1 g; 腆化专甲:2g; 蒸馆水:300mL。将确与腆化伺先进行混合，加入蒸锢水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mL。C6.3 沙黄复染液沙黄:0.25g; 95%乙醇:10mL; 蒸锢水:90mL。将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸悟水稀释。C6.4 染色法C6.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色攘，染1min，水洗。C6. 4.2 滴加革兰氏腆液，作用1min，7.1洗。C6. 4. 3 滴加95%乙醇脱色，约30s 。C6. 4. 4 水洗，滴加复染液，复染1min。水
15、洗，待干，镜检。C6.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。C7 嗜盐性试验C7.1 成分多价蛋白陈:2g; 氧化铀:按不同量分别加入;蒸馆水:100mL。白白白F|F山队。SN/T 0751-1999 pH7.7 c? 2 制法配制2%蛋白陈水，校正pH，共配制三瓶，每瓶100mLo每瓶分别加入不同量的氯化铀:(1)不加;(2)3 g; (3) 6 g。待溶解后分装试管121C高压灭菌15min。HZ 甘露醇、肌醇、七叶苦、水杨素、拧攥酸盐、阿拉伯糖发酵试验培养基C8.1 成分牛肉膏:5g; 蛋白陈:10 g; 氧化饷:3g; 磷酸氢二铀:2g; 0.2%澳膺香草盼蓝洛液:12mL
16、; 蒸馆水:1 000 mL。pH7.4 C8.2 各种糖发酵管按上述成分配好后，分装每瓶100mL, 121C高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基中，以无菌操作分装小试管。C8.3 试验方法从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36C士1C培养，一般观察23do微量管24h后观察。C8 不得翻印制一元ru-nu -nu -nku phu nu-LF-川=E唱-，AliN一定奇峰版权专有中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中嗜水气单胞菌检验方法SN/T 0751-1999 9号中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电i舌:68522112 , 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售版权专有不得翻印9唔开本880X12301/16 印张3/4字数16千字1999年9月第一版1999年9月第一次印刷印数1-20009峰书号:155066 2-12696 定价8.00元
