1、:才中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN /T 1059. 2-2002 进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法Total coliform and escherichia coli counts in food for import and export-Membrane filter /MUG method 2002 -01-16发布2002 - 06 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检痊总局SN /T 1059. 2-2002 前本标准是按照GB/T1. 11993(标准化工作导则第1单元:标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定进行编写的。其中大肠菌群
2、、大肠杆菌计数滤膜/MUG法的培养基、培养温度和滤膜法等内容，是参考美国公职分析化学家协会(AOAC)(公定分析方法(1995年第16版17.3.09)，结合SN0169-1992(出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法中样品制备并在实验的基础上编写的。本标准的附录A是标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国天津出入境检验检疫局负责起草。本标准起草人:陈子红、侯丽萍、唐丹舟、张思传、孙俐。本标准首次发布。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法Total coliform and escherichi
3、a coli counts in food for import and export-Membrane filter/MUG method 1 范围本标准规定了进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法。SN/T 1059.2-2002 本标准仅适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、单晶糖、饮料、椒粒、牛奶(需用蛋白酶处理)中大肠菌群、大肠杆菌的计数滤膜/MUG法检验。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。SN 0330-1994 出口食品中微生物
4、学检验通则3 抽样按SN0330规定执行。4 检验方法4. 1 方法原理将滤膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用，大肠菌群、大肠杆菌保留在膜表面。大肠菌群在乳糖莫能霉素葡萄糖醒酸(LMG)琼脂平板上经培养后产生蓝色菌落。大肠杆菌经培养后产生的葡萄糖昔能降解荧光底物4-甲基伞形酣冉D葡萄糖昔酸(MUG)并释放4甲基伞形酣荧光物质，在波长366nm长波紫外光(UV)灯下MUG阳性菌落呈蓝白色荧光。4.2 设备和材料4.2.1 滤器:一套，备有预滤器。4.2.2 真空泵。4.2.3 长波紫外光(UV)灯:波长366nm。4.2.4 滤膜:有机或水相，孔径0.45m。4.2.5 培养箱:36 C :I
5、: 1 C 0 4.2.6 水浴箱:45C士1C。4.2.7 吸管:1mL、10mL.具刻度。4.2.8 玻璃三角瓶和广口瓶:500mL。4.2.9 试管:17 mm X 170 mm.玻璃制。4.2.10 玻璃珠z直径5mm。中华人民共和国国家质量监督检验检擅总局2002-01-16批准2002- 06-01实施4.2.11 平皿:直径90mm。4.2.12 天平:感量0.1g 0 4.2.13 均质器。4.2.14 乳钵和研棒。4.3 培养基和试剂SN /T 1059. 2-2002 4. 3. 1 蛋白陈-吐温80(PT)稀释液(见附录AAl)。4.3.2 乳糖莫能霉素葡萄糖酸琼脂(LM
6、G)(见附录AA2)。4.3.3 缓冲MUG琼脂(BMA)(见附录AA3)。4. 3. 4 三(捏甲基)胶甲皖(Tris)缓冲flj(见附录AA4)。4.3.5 膜蛋白酶贮存液(见附录AA5)。4.4 样品制备4.4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于一15C保存;非冷冻而易腐的食品，应置于4C冰箱保存。检验前冷冻样品可于2C5CC18h内解冻，或在45CC以下15min内解冻。4.4.2 样品匀液的制备4.4.2.1 液体食品以灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL PT稀释液的500mL灭菌广口瓶(瓶内预置适当数
7、量的玻璃珠)，以80cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1: 10的样品匀液。4.4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取25g样品，放入装有225mL PT稀释攘的灭菌均质杯内，于8000 r/min均质1 min2 min.制成1: 10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。4.4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用PT稀释液将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10 2、103、104. .。从制备样品匀液至稀稀完毕，全过程不得超过15min。4.4.4 需要酶处理的食品取1: 10 PT稀释液10mL加酶原液1mL.在灭菌试管中棍合放人36CC:
8、f:1C水捕中处理20 min30 min.取出过滤。4.5 过洁、对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，每个稀辞度的样液分别过滤两次，将灭菌的过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上，用不锈钢夹子固定。以无菌操作加10mL20 mL元菌蒸锢水于滤器中，加入PT样品匀液10mL，打开真空泵，抽吸过滤，再加人10 mL15 mL元菌蒸馆水，抽吸过滤，关闭真空泵。用无菌慑子将滤膜取出。4.6计数4.6.1 大肠菌群计数以无菌操作将滤膜取出放于预先干燥的LMG琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36C士1C培养箱培养24h士2h。选用25250个菌落的平板，
9、计数所有蓝色(包括深或浅蓝色)的菌落。滤、膜上的菌落数乘以稀释倍数即为每克(毫升)(g(mL)J食品中大肠菌群数。4.6.2 大肠杆菌计数将有大肠菌群的滤膜放入预先干燥好的BMA琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36C士lC培养箱培养2h.在暗室或紫外操作室内用波长366nm UV灯观察滤膜上的菌落是否有蓝白色荧光。选用25250个菌落数的平板，计算所有带蓝白色荧光的菌落数，乘以稀释倍数即为每克(毫升)(g(mL)J食品中大肠杆菌数。2 SN /T 1059. 2-2002 附录A(标准的附录)培养基和试荆A1 蛋白陈-吐温80(PT)稀择液a)蛋白陈b)吐温801. 0g 10
10、.0 g c)蒸铺水1 000 mL 将上述成分加热溶解分装90mL于三角瓶中，121C ,15 min高压灭菌。A2 乳糖莫能霉素葡萄糖醒酸琼脂(LMG)a)膜蛋白陈b)蛋白脏、c)酵母膏d)乳糖e)莫能霉素10.0 g 5.0 g 3.0 g 12.5 g 0.038 g(榕解在10mL 95%酒精里)f)苯胶蓝0.1 g g)葡萄糖醒酸铀盐0.5 g h)硫酸十七皖基铀盐0.25 mL i)琼脂15 g j)蒸锢水1 000 mL 加热煮沸，不能高压消毒，温度冷至45C50C无菌操作，调整pH最终为7.2土O.1。倾注平板，打开皿盖在35C温箱，15min20 min烘干备用。A3 缓冲
11、MUG琼脂(BMA)a)磷酸氢二铀8.23 g b)磷酸二氢铀1. 20 g c)氯化锅5.0 g d)今甲基伞形嗣-D-葡萄糖昔酸(MUG)0.1 g e)琼脂15.0 g f)蒸馆水1 000 mL 溶解加热煮沸，调整pH7.27. 6, 121C , 15 min高压灭菌。温度冷至45C50C，倾注平板。A4 Tris缓冲剂(1.0mol/L)。溶解121.1 g三(握甲基)胶甲皖于500mL水中，用浓盐酸调节榕液至所需pH值。用水稀释至1L。室温4C6C保存。A5 膜蛋白酶贮存液:用Tris缓冲剂稀释10g膜蛋白酶(DoifcoNo. 0153或等效品)至100mL , pH7.6。如
12、需要加热至35C以助搭，通过WhatmanNo. 1滤纸(或等效品)过滤以除去不溶物质，再用0.45m滤膜过滤除菌。于4C6C保存一周或一18C保存3个月。NOON-N.BOF 同Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食晶中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法SN/T 1059.2-2002 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9峰开本880X1230 1116 印张1/2字数9千字2002年5月第一版2002年5月第一次印刷印数1-20007c 定价6.00网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533峰书号:155066. 2-14385
