1、中华人民共和国出入境检验检摄行业标准SN/T 374 1. 2-20 13 国境口岸民或类携带病原体检测方法第2部分;土拉弗朗西斯菌PCR检测方法Detection for pathogens of rodents at frontier ports Part 2: Detection for FrnciselltulrenS1S 2013-11-06发布2014田06-01实施d哇13720，.，吃fI-.守令扩4蝇、p在?一.-、柿. 气，宫、。. V非乓吨.d。叹，科气昂明如俨中华人民共和国发布国家崩量监督检验脸疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸鼠类携带病原体检视u方法第
2、2部分:土拉弗朗西斯菌PCR检测方法SN/T 374 1.2-2013 毛中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)64275323网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷争争开本880X12301/16 印张0.5字数10千字2014年5月第一版2014年5月第一次印刷印数1-1600 当书号:155066 2-26951 定价14.00元SN/T 3741.2-2013 目。吕SN/T 3741(国境口岸鼠类携带病原体检测方法共分为2部分:一一第1部分:致病性钩端螺旋体PCR检测方法;第2部分:土拉弗朗西斯菌P
3、CR检测方法。本部分为SN/T3741的第2部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本部分主要起草人:孙肖红、刘丽娟、侯中生、刘键、罗忠鑫、杨学兵、胡克林、杨宇、胡孔新、王静。1 范围国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分:土拉弗朗西斯菌PCR检测方法SN/T 374 1. 2-2013 SN/T 3741的本部分规定了国境口岸鼠类样本采集、处理方法、土拉弗朗西斯菌PCR检测的方法和结果判定。本部分适用于国境口岸鼠类携带病原体检测。2 规范性引用文件下列文件
4、对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 鼠类rodent 与鼠传疾病有关的鼠形动物(包括啃齿吕、兔形自和食虫目动物)。3.2 土拉弗朗西斯菌Franciselltularensis 属于弗朗西斯菌属CFrancisella)，是引起的土拉弗朗西斯菌病CTularemnia )的病原体。土拉弗朗西斯菌病是一种人兽共患急性传染病，在多种野生动物中流行，人和动物通过接触染疫的动物或感染的水、气溶胶以及吸血
5、昆虫(蝉、蚊、蛇)叮咬而感染和传播。野兔是土拉弗朗西斯菌病的主要宿主，人类常因捕猎或接触野兔而受到感染，所以本病又被称为野兔热。由于微量土拉弗朗西斯菌即可引起感染，故可以作为生物武器使用，因此备受重视。4 要求鼠类携带病原体检测应在生物安全2级以上实验室(BSL-2)内进行。实验室应遵循GB19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。5 实验仪器设备主要仪器如下:高速台式冷冻离心机;组织研磨仪;一一生物安全柜;SN/T 3741.2-2013 电泳仪;凝!庭成像系统;一-PCR仪;一一微量加样器(10L、20L、100L、200L、1000U; 冰箱(2oC8 oC和20oC-80 O
6、C)。6 主要试剂6.1 核酸提取试剂:组织DNA提取试剂使用天根公司TIANampGenomic DNA kit)。6.2 PCR t式齐。:dNTP、10XPCR6.3 引物:上游引物Fop1序列。拟在与飞3注穿军毛主法穹CTATCGC，下游引物Fop5序列f轮点也在协裕郑之沁巧川之了三三:必:该3(5 -3) : T ACCCCTCTGCCA 6.4 氧化错颗粒(直径3mm)。6.5 RPM 1640培养液。7 PCR检测7.1 样本DNA的提取按照附录A进行。7.2 反应体系的配制在200L的PCR反应管中，dNTP(2.5 mmol!UO.5L、10酶0.15L，模板DNA2L，总应
7、体系瞬时离心，放入PCR仪7.3 反应条件PCR反应条件为95oC 5 7.4 结果判定取5LPCR产物进行2%琼脂糖电4.35L、10X PCR缓冲液2L、下游引物0.5L、(5U/L)Taq 和空白对照。将配制完成的反30 s , 35个循环，72oC 10 min。在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现550bp的扩增条带条件下，如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品未检出土拉弗朗西斯菌基因片段;如待测样品出现550bp扩增条带则可判定该样品检出土拉弗朗西斯菌基因片段。如果阴性对照、空白对照出现条带和或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新检
8、测，并排除污染因素。2 1) 由指定单位提供，给出这一信息是为了本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品。SN/T 3741.2-2013 附录A(规范性附录)鼠类脏器标本采集、处理方法A.1 鼠类标本采集A.1.1 取材范围在口岸地区本底调查或监测范围内捕获的鼠类或在该范围内收集的自毙鼠类。A.1.2 取材方法A. 1. 2.1 将获得全部应检鼠类分类、编号登记，单只装入鼠袋内，活鼠麻醉或处死后，分拣体表寄生虫，并分类鉴定，然后解剖采样。A.1.2.2 自毙、染病萎靡鼠类，按照常规方法解剖后，取肝脏、牌脏，装入2mL细胞冻存管中，尽快送检或低
9、温保存。A.2 检测用鼠脏器的处理方法A.2.1 土拉弗朗西斯菌检测的样品处理A.2. 1. 1 组织样品的研磨分别取10mg脾脏、30mg肝脏，用生理盐水洗一次，置2mL的圄底离心管中，加入3颗直径3 mm的氧化错颗粒，再加入0.5mL的RPM1640培养液，用组织研磨仪4000次/min振荡60s.直至元肉眼可见的组织块，即为组织匀浆液。A.2.1.2 组织DNA提取方法一使用天根生物公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型产。A.2.1.2.1 将组织匀浆液4oC 10 OOOg离心1min.弃尽上清液。A.2.1.2.2 加20OLGA缓冲?液夜，充分振荡1巳5s.室温放置
10、I川Om口llnA.2.1.2.3 加入4OLRNaseACl刊Om丑19/m口lL)，振荡l臼5s，室温放置5min口。A.2.1.2.4 加20fLL Protease K，颠倒?混昆匀，5臼6oC水?浴谷3h。A.2.1.2.5 加200LGB缓冲液，颠倒棍匀，700C水洛10min。A.2.1.2.6 加200fLL元水乙醇，充分振荡15s，将全部液移入柱子中，12000g，短暂离心30So A.2.1.2.7 弃废液，加500LGD缓冲液，12OOOg离心30s。A.2.1.2.8 弃废液，加700LPW缓冲液，12OOOg离心30s 0 A.2.1.2.9 弃废液，加500LPW缓
11、冲液，12OOOg离心30s 0 A.2. 1. 2.10 弃废液，12OOOg离心2mino A.2.1.2.11 将离心柱放入新套管中，室温放置5min。A.2.1.2.12 向吸附膜的中间部位悬空滴加50fLL洗脱缓冲液，室温放置2min 2) 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2日|N.sh的H军SN/T 374 1. 2-2013 12 OOOg离心2min。收集液即为DNA。A.2.1.2.13 组织DNA提取方法工A.2.1.3 使用Qiagen公司的DN巳asyBlood & Ti
12、ssu巳Kit3)。将质量不超过25mg的组织剪成碎块，置于1.5mL离心管中，加180LATL。加20L蛋白酶K，旋涡振荡?昆匀，56oc孵育(孵育过程中不时振荡以分散样品)至组织完A.2.1.3.1 A.2.1.3.2 全裂解。A.2.1.3.3 振荡氓匀。A.2.1.3.4 将得到的、混合物转移至DNeasyMini spin columnC置于2mL collection tube中), 6 OOOg离心1min，弃掉滤液和collectiontube。A.2.1.3.5 将DNeasyMini spin column置于另一新collectiontube中，加500p.L缓冲液AW1
13、，6000g离心1mi口，弃掉滤液和collectiontube。A.2.1.3.6 将DNeasyMini spin column置于另一新collectiontube中，加500L缓冲液AW2，20OOOg离心3min，弃掉滤液和collectiontube。A.2. 1. 3.7 将DN巳臼as叮yMin丑nl扎1S叩pm口1Coh盯m置于另一干净的1.5m丑lL或2mL离心管，取20OL缓冲液AE直接加到DN巳臼as叮ym巳mbrane中，室温下膊育1min口，60OOg离J心L1 min以洗脱DNA。旋涡振荡15So加200L缓冲液AL，旋涡振荡?昆匀，加200L乙醇C96%100%)，旋涡由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3) 书号:155066 2-26951 定价:14.00元3741.22013
