1、中华人民共和国出入境检瞌检疫行业标准SN/T 3767.11-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第11部分:玉米MON89034晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticaUy modified components in food for export-Part 11 : Maize MON89034 2014-01-13发布2014-08-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检痊总局SN/T 3767.11-2014 目。SN/T 3767(出口食品中转基因成
2、分环介导等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第
3、18部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜日7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第11部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家
4、认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中国检验检疫科SN/T 3767.11-2014 学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、仲也农业工程学院、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:刘静宇、凌莉、蔡颖、刘津、谢力、李晓虹、郑文杰、陈颖、曹际娟、冯家望、曾静、李志勇、高苏娟、石磊、张隽、陈源树、李婷、关丽军。H SN/T 3767.11-2014 出口食品中
5、转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第11部分:玉米MON89034品系1 范围性的环介导等温扩增(LAMP)初SN/T 3767的本部分规定了筛检测方法。本部分适用于玉米及其加本方法的定性检测低限为0:特异性成分的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应件。凡是不注目期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室GB/T 19495.2 转基因产件，仅注日期的版本适用于本文A i nu 叮/UO Jnhu 勺tqUT , W川法方选(LAMP)检测方法第2部分:筛3 防污染措施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/
6、T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因玉米MON89034品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特SN/T 3767.11-2014 异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。寻|物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在玉米MON89034品系特异目标序列启动互补链合戚，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNAy昆合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应洛液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显
7、色原理SYBR Gr巳巳口I是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DN人的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0oC:!:0.5 oC和80.0oC :!:0.5 oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;
8、量程10L100L;量程100fJ.L 1 000L。6.2.5 :十时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs Y容液:每种核昔酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/fJ.L。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCICpH值8.8)、100mmol/L硫酸接、100mmol/L 氧化押、20mmol/L硫酸镜、1%Triton X-100。6.3.5 硫酸续溶液:5
9、0mmol/L 6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:SYBRGree口I荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米MON89034品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物20外引物扩增片段长度:245 bp 夕卡引物1(F3 , 5 -3 ) : TTGCTTTCGCCT A T AAA T ACG 夕卡引物2C B3 ,5 -3 ) : G AAACTTTGGG TTG AAA TG AAA T 内引物l(FIP，5人3):GTAGATGTCCGCAGCGTTATTATAAACGGATCGTAATTTGTCGT内引物2
10、C BIP , 5 -3) : A TTG ACCA TCA T ACTCA TTGCA TCCCCAA T ACTCAAAAAA T AAC ACGG 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:SN/T 3767.11-2014 采用含有目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板，浓度应略高于方法检测低限。6.4.1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对H在(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA?容解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测L
11、AMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米MON89034品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应吏样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1玉米MON89034品系LAMP反应体系组分工作液浓度如J!佯量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 外引物1CF3) 10 /.L mol/L
12、 0.5 0.2/.L mol/L 外号|物2C日3)10 f.L mol/L 0.5 0.2 /.L mol/L 内引物1C FIP) 40mol/L 1. 0 1. 6 flmo l/L 内引物2CBIP)40 /.L mol/L 1. 0 1. 6 f.L mol/L dNTPs 10 mmol/L 3.5 1. 4 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mol/L 硫酸续150 mmol/L I 6 mmol/L Bst DNA聚合同每8 U/L 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L 补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 oc士0.50
13、C恒温扩增90mi口，80.0oC土0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻泪匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。3 SN/T 3767.11-2014 7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴
14、性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因玉米MON89034品系初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 按照欧盟的方法(CRLVL06/06VP)进行实时荧光PCR检测;一一可对外引物PCR扩增产物进行序列测定。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 4 口7;口口习之。证实验情况进行结果判断和表述。SN/T 3767.11-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米MON89034品系基因序列A.1 转基因玉米MON89034品系外源基因和玉米边界序列TTGCTTTCGCCTATAAATACGACGGATCG
15、TAATTTGTCGTTTATCAAATGTACTTTCA TTTTATAATAACGCTGCGGACATGTAGATTTTTGANFTGAAA:AAAAATTGGTAATACTCT TTCTTTTTCTCCATATTGACCATCATAC丁CATTGCATCCCCGGAA盯TATGTTTTTTTAAAAACACGGTATTATAGATACCGTTTATTTTTTGAGTATGGAATTTCATTTCAACCCAA AGTTTC A.2 引物眼基序列及构成F3 : TTGCTTTCGCCT A T AAA TACG 3 :GAAACTTTGGGTTGAAATGAAAT / J , 一/ f h
16、一J r r / / / / / / 2 / / / / / / 一叫+在Flc B2 FIP:嘎GTAGATGTCCGCAGCG:fTATTATAA今人巴GGA:J:GG主AATTTGTCGTBlc illP: ATTGACCATCATACTCATGCATCC 5 ZON|二.hh伺H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第11部分:玉米MON89034晶系SN/T 3767.11-2014 兴中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区主里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址www.spc.丑中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷毛印张0.75字数10千字2014年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元兴书号155066.2-27465SN/T 3767.11-2014
