1、中华人民共和出入境检验检疫行业标准SN/T 3767. 13-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)栓测方法第13部分:玉米3272晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 13: Maize 3272 2014-01-13发布2014-08-01实施也;气击家在量坠击金品金JE总自发布SN/T 3767.13-2014 目U共民人华任中莉分愤院攻立口。制究津U字桥圳州路一悖勇韭山这也
2、古士也别疫李法口川佳、山川斟酌湖贺民金。布收和剧捐忡忡P-构白川剧咱们血刊局验丰乡门山时疫检颖嘈2。检境陈的口扩丰丑验人-K、制轧刘荆刷刷川职阅本础入广3时删矶刽制榈脏。的专员天共刘时!MM百二百和协际品时制酬报耐烦在?呆呆呆M节日川川呆呆骂:川之主巳LM协MAt旦时牌剧中院品品品但Mmm阳刚咱咱也忏肌肌灿wm川咄咄LE品扑斗机咱付呻卜内刚从口肌悄叫时EUmmmmmmNmmMmmUE盯阳川阳Mmm阳盯mu脏削刑帧川米米米米米豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜T韧的认位验草出用选米米米米米米米玉玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小甜油G件家单检起同喃地而44玉玉玉玉立. g照文国草境要.分分分分分
3、分分JLA分分才才才分分分分分分分7分分分分分AJLJLJLJii为按本由起入主门部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部分分意分分出分nu-nLqu4rD07OOQdnu-nLqdA吐EUb7OOQnuvl23456789111111111122222222223部部注部部海部卧第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本珠本国nH Z中I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第13部分:玉米3272品系SNjT 3767的本部分规定了玉米露糖异构酶PMI的环介导等温扩增(本部分适用于进出口的玉米及初本方法的定性检测低限
4、为1.0%(2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必件。凡是不注日期的引用文件，其最新GBjT 6682 分析实验室用水规GBjT 19495.2 GBjT 19495.3 转基因产品检测GBjT 19495.7 转基因产品检测SNjT 3767.2-2014 选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防4 抽样与制样按照GBjT19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GBjT19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理SNjT 3767.13-2014 -淀粉酶797E和磷酸甘注日期的版本适用于本文件。P)检测方法第2部分:筛根据转基因玉米
5、3272品系外源基因磷酸甘露糖异构瞄PMI和高温淀粉酶(797E)(参见附录A)SN/T 3767.13-2014 设计特异性内引物和外引物各一对，特异性识别目标序列上的六个独立区域.利用Bst酶启动循环链置换反应，在玉米品系3272特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA昆合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加入预先说合的钙黄绿素和瞌离子，未发生反应时组离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被碎灭
6、，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与锚离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锺离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镜离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC士0.5oC和80.0oC士0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100fJ-L;量程100fJ-L 1 000L 6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规
7、定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶:酶浓度8U/fJ-L，建议采用NEB的Bst酶，或者具有同等效力的酶。6.3.4 10 Thermo1Pol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸接、100mmol/L 氧化饵、20mmol/L硫酸镇、1% TritonX一100。6.3.5 硫酸馍榕液:50mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5 mol/Lo 6.3.7 显色液:钙黄绿素荧光染料，0.312
8、mol/L。6.3.8 引物:根据转基因玉米3272品系外源基因磷酸甘露糖异构酶PMI和高温淀粉酶(797E)分别设计一套特异性引物，包括外引物1、外引物2、内引物1和内引物202 磷酸甘露糖异构酶PMI等温扩增引物:外引物l(F3，5 -3): TCCCGATTCCAGTGGATGA 夕卡引物2(B3,5-3) : ACAGTCACCGGTGATTCGT 内引物1(FIP , 5 -3 ) : ACAAAA TGGCGGCACTCTGCTGCCTTCTCGCTGCA TG AC 内引物2(BIP，5人3): CGTCGAAGGCGATGCAACGTGGCGGCAAT AAACGCTGAT 外
9、引物扩增片段长度193bp，序列信息见附录A。高温淀粉酶(797E)等温扩增引物:外引物l(F3，5-3):AGGCATCTGGTGGGACAC 外引物2(B3 , 5 -3 ) : TCCTGCTTGG ACCCG AAG 内引物1(FIP，5-3):GGAAGCTGGCGGTATCCAGATCGCCAGAAGATCCCCGAGT 内引物2(BIP , 5 -3 ) : CTCG A TGGGCT ACG ACCCG T ACCG TGCCCTTCTGG T AG 外引物扩增片段长度195坤，序列信息见附录A。SN/T 3767.13一20146.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和
10、空白对照的设置6.4. 1. 1 阴性对照采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照采用含有待测基因序列的檀物DNA作为模板。6.4.1.3 设两个空白对照一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一一LAMP反应的空白对照(以DNA榕解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米3272品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品做两个外源基因检
11、测，每个检测各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1玉米3272品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 1 外号|物1(F3) 10mol/L 0.5 0.2mol/L 外号|物2CB3)10mol/L 0.5 0.2 !1 mol/L 内引物1(FIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2CBIP)40mol/L 1.0 1.6mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mm
12、ol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续150 mmol/L 1 6 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L I 0.32 U/L DNA丰莫板100 ng/L 2 8 ng/!1 L 水补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 C士0.5C恒温扩增90min , 80.0 C =1: 0.5 C 5 min使酶灭活，反应结束。3 SN/T 3767.13一-20146.4.5 显色反应反应结束后，立即将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否
13、则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿7 结果判断和确证7.2 待检样品PMI2个平行样反应管中呈绿色，同时各种实验对照结果正常，之一进行确证(见附录A): 一一按照欧盟的方法CCRVL03/可对外引物PCR扩增产物8 结果表述8.1 对PMI和797E两个外源基因8.2 检测结果为转基因玉米32724 反应管中液体均呈橙色，同时因玉米3272品系。果判断和表述。SN/T 3767.13-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米3272品系外源基因序列A.1 转
14、基因玉米3272品系外源基因797E和PMI的序列(来源于WO2006/098952 A2) 1 51 101 151 1 51 101 151 797E序列A.2引物碱墓叫构成二外引物l(凹，5一3): 外引物2(白，5心，) : 内引物l(FIP，5一3): 内引物2(BIP，5-3): 高温淀粉酶(797E) 外引物l(凹，5-3) : 外引物2(凹，5-3) : 内引物l(FIP，5一3): F2 TTCTCGCTGCATGAC B2 GCAATAAACGCTGAT Blc B2 内引物2(BIP , 5 -3 ) : CTCG A TGGGCT ACG ACCCG T ACCG TG
15、CCCTTCTGG T AG 5 立ONl巳.h忌同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第13部分:玉米3272品系SN/T 3767.13-2014 兴中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网:lJl: 中国标准出版杖秦皇岛印刷厂印刷X 印张0.75字数10千字2014年11月第一次印刷开本880X12301/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元3号书号:155066 2-27467 SN/T 3767.13一2014
