1、华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3767.15-2014 食晶中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第15部分:大豆A2704-12晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 15: Soybean A2704-12 2014-01-13发布2014-08-01实施气。lms伪吨。如拙坦-AH白吗卢川仲日1甲斜h如川。的咱川忡冈中华人民共和国发布E国家质量监督雄验桂、度总局SN/T 3
2、767.15-2014 目。SN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第四部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A
3、5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻lBt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻lKMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻fM12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第15部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容
4、可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:邵碧英、陈文炳、高东微、李志勇、常彦磊、凌莉、刘津、郑品、陈桦、缪婷玉、彭娟。I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第15部分:大豆A2704-12品系SN/T 3767.15-2014 SN/T 3767的本部分规定了大豆及其制品中转基因大豆A2704一12品系特异性的环介导等温扩增CLAMP)初筛检测方法。本部分适用于大豆及其制品本
5、方法的定性检测低限为o.2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室用GB/T 19495. 2 转基因产GB/T 19495.3 转基因产SN/T 3767.2-2014 出口选方法转基因植物及其产品成分1485号公告一俨2010)3 防污染措施环介导等握扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. l. 1 一般原理CLAMP)检测方法第2部分:筛生品种定性PCR方法(农业部根据转基因大豆A2704-12品系外源基因和大豆边界
6、序列设计特异性内引物、外引物和环引物各SN/T 3767.15-2014 一对，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在大主A2704-12品系特异目标序列启动互补链合成，在同一一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镇)形成乳白色沉淀，加入显色眩，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA
7、结合时，荧光信号是游离状态的8001 000 倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由隆色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水洛锅或加热模板:63.0 oC土0.50C和80.0oC :!:0.5 oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5LlOL;量程10L100 fLL;量程100L1 000 fLL。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有
8、试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核昔酸放度10mmol/L。6.3.3 BstDNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/ fLL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCICpH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100mmol/L 氧化押、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸镜溶液:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/Lo 6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，10
9、00。6.3.8 引物:根据转基因大豆A2704-12品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物l、外引物2、内引物1、内引物2、环引物l和环引物2。外引物扩增片段长度:266 bp 外引物1CF3 , 5 -3) :GACACATCTCATTGCACTGA 外引物2CB3，5-3) :CGAGTTCTGTTAGGTCCTCTA 内引物1CFIP , 5 -3): TGGCGTAATAGCGAAGAGGCGTGAGTTATTTATCAGCCAAGC 内引物2C BIP , 5 -3 ) : GG A TGTGCTGCAAGGCG A TTT ACAACGTCG TG ACTGG
10、环引物l(FLP，5一3): CCGCACCGACAT AAGAAGA 环引物2CBLP，5-3) :AAGTTGGGTAACGCCAGG 6.4 实验步骤6.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4. 1. 1 阴性对照:SN/T 3767.15-2014 采用不含有目标基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳t生又才照:采用含有目标基因序列的植物DNA或质粒DNA为模板，浓度应略高于方法检测低限。6.4 .1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNAi容解液代替DNA模根)。6.4.2 内源基因检测LAMP
11、检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。力日样时应使样品DNA恪液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1p.L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液棍合进入反应液中。表1大豆A2704-12品系LAMP反应体系组分工作液浓度力日样最/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 外寻|物1(F3) 10mol/L 0.5 0.2 flmol/L
12、外寻|物2CB3l10mol/L 0.5 0.2mol/L 环寻|物lCFLPl40mol/L 0.5 0.8mol/L 到、引物2CBLPl40mol/L 0.5 0.8 flmol/L 内引物1cFIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2CBIP) 40 flmol/L 1. 0 1. 6 flmol/L c1 NTPs 10 mmol/L ,1. 0 1.6日1mol/L甜菜碱5 mol/L 6.0 1. 2 mmol/L 硫酸镇150 mmol/L 1. 0 6.0 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L 1.0 0.32 U/L DlA模板100 ng/L
13、2.0 8.0 ng/L 水补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 C土0.5C恒温扩增60mi日，80.0C土0.5C 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果SN/T 3767.15-2014 出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品
14、2个平行样反应管中液体均呈撵色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因大豆A表述。4 实验对照结果正常，可判断该样品系。照确证实验情况进行结果判断和SN/T 3767.15-2014 附录A(资料性附录)转基因大豆A2704-12品系目标基因序列及LAMP51物A.1 转基因大豆A2704-12品系外源基因和大豆边界序列1 GACACATCTCATTGCACTGATCGGGGGCGTTCGTAGTGACTGAGGGGGTCAAAGACCAAG 61 AAGTGAGTTA TTTATC
15、AGCC 121 181 241 A.2 F3 , B3: FLP: BLP:AAGTTGGGTAACGCCAGG FIP: Blc BIP , GGATGTGCTGCA 俨J 寸FONlFKh的H在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第15部分:大豆A2704-12品系SN/T 3767.15-2014 -中国标准出版社出版北京市朝阳区和平盟西街甲2号(100029) 北京市西城区主里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷.x. 印张0.75字数10千字2014年11月第一次印刷开本880X12301/16 2014年11月第一版印数1-1300 7G 定价16.00* 书号:155066 2-27469 SN/T 3767.152014
