1、人何门何?采飞出验检电每5 SN/3767.19-2014 t:l1=I 等温扩增(LAM现48978 直MLoop-mediated isothermal a脑plificationdetection mehod for geneticaIly modified components in food for export-Part 19 :Soy岳eanMON89788 2014-01-13发布2014-08-01实施中华人员共自家庭走量监督撞撞检接总发布SN/3767.19-2014 F.l IJ 疫科呈检物验生弘检澳VLV任境迪玉MM责人州小叶怕出广王U为特曰局部才些骂疫曾共这盹地札d川
2、J立叶Z川-卫L亨由中用共创版方肌只剧游恻展UV入耳不抖出志盯构du京机局北伞、川山布疫国现部发。检和接的口险共民事甜。件归也民阳牟草文并境人导起本吐入华明刊。提i中食阶规利会时iMELLL品协品且旦出阴阳LL呆呆际协嘟嘟肌立在叫叫叫盹呆在叫呆在PE川同时耳旧中定口口品品24168的口阳品-47608I口阳品口C品11-E口3的一人人阳和h6lmMmmm522mmmmm悦目时阳启2巳AKUm川UU7蚓川华出胡叫黯-MM阳山mmmmMMMmmAADGMKKKKU阳口町HRmu某证冲东zh。米米米米米豆豆豆豆豆存在在布在稻稻稻麦菜菜T町的认位广草磊咄酬帖MMMMMMM玉王玉玉大大大大大水水水水水水
3、冰冰冲础抽町G件家单惘起彦mA川弘弘弘八如八川弘弘八仙时时时附时抑制时时时时时时时时时附时时时时如咖收回畔阳。四阶T部部部部部部部部部012345678901234567890分/刀童少阶人吁阶附vw123456789111111111122222222223部部注部音医生音。山第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本J什限本登仁、有李局技刘SN/T 3767.19一2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第19部分:大豆MON89788品系1 范围SN/T 3767的本部分规定了大豆及其加工产品中转基因大豆MON89788品系特异性的环介导
4、等温扩增CLAMP)初筛检测方法。民古雪夜雪雾二污言三苦本部分适用于大豆及其加声言揉搓基因头盖边注涵的左边象特异性的定性检测。本方法的定性检测低11良为2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件GB/T 6682 分析实验室GB/T 19495.2 转基因产GB/T 19495.3 转基因产RC CRL VL05/06VP for the Quantification of Soy 3 防污染措施环介导等温扩增检测4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸、提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般
5、原理增CLAMP)检测方法第2部分=筛量PCR法CEv巳nt-specificMethod PCR) 根据转基因大豆MON89788品系外源基因和大豆边界序列(参见附录A)设计特异性内引物和外SN/T 3767.19-2014 引物各一对，特异性识别目标序列上的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合戚，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的MgZ-1结合，产生副产物(焦磷酸镇)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结
6、果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板
7、:63.0 oC土0.5oC和80.0oC土0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L。6.2.5 i:十时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶放度8U/.uL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/LTris-HCl(pH值为8.8)、100m
8、mol/L硫酸钱、100mmol!L氧化押、20mmol!L硫酸镜、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸镜溶被:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:SYBRGree口I荧光染料，1000。6.4冒|物根据转基因大豆MON89788品系外源基因和大豆边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物l和内引物20夕i、引物扩增片段长度:260 bp 夕卡引物1(F3 , 5 -3 ) : AGCGCTTCAA TCG TGGTT 外引物2(B3，5人3):TGCATGTGCTGGAACAGT 内引物1(FIP , 5 -3 ) : AG
9、 AAGCTTG A T AACGCGGCCGCGGG AAACG ACAA TCTG A TCC 内引物2(BIP , 5 -3 ) : CAGG TCCTGCTCG AG TGG AA TGG AG ACTCTG T ACCCTG A 6.5 实验步骤6.5.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.5. 1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2 SN/T 3767.19一20146.5.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.5.1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代
10、替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.5.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA，可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.5.3 大豆MON89788品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA洛液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1大豆MON89788品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反
11、应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2. 5 l 外引物lCF3)10mol/L o. 5 0.2 flmol/L 外引物2(B3)10 flmol/L O. 5 O. 2mol/L 内寻i物1(FIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2(BIP)40 flmol/L 1. 0 1. 6 flmol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 5 1 mol/L 硫酸续150 mmol/L 1 6 mmol/L Bsl DNA聚合酶8 U/L 1 0.32 U/flL DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L 水补足至2
12、5.0 6.5.4 LAMP反应参数63.0 C :!:0.5 C恒温扩增90min ,80.0 C :!:0.5 C 5 min使酶灭活，反应结束。6.5.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻泪匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.6 质量控制6.6.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.6.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.6.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。3 SN/3767.19-2014 6.6 .4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反
13、应管中液体均呈憧色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因大豆MON89788品系初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一一按照RCCRL VL05/06VP进行实时荧光PCR检测;一一可对外引物PCR扩增产物进行序列测定。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 4 88品系。证实验情况进行结果判断和表述。SN/T 3767.19-2014 附录A(资料性附录)转基因大豆MON89788品系基因序列A.1 转基因大豆MON89788品系外源基因和大豆边界序
14、列(Accessionno. GV 597339.1) 1077 AGCGCTTCAATCGTGGTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTAAACTGAAGGCGGGAAA 1257 院总1317 TACTGTTCCAGCACATGCAT A.2 引物碱基序列及构成F3: AGCGCTTCAA TCGTGG B3: TGCA TGTGCTGGAACAG F1c FIP: AGAAGCTTGATAA B1c BIP , CAGGTCCTGCTCGAG 5 寸FON-.khkh的HZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第19部分:大豆MON89788品系SN/T 3767.19-2014 争号中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三旦河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷只印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷1/16 2014年12月第一版印数1-1300 开本880X 1230 定价16.00元?飞一书号:155066 2-27473 SN/T 3767.19-2014
