1、境笔等2 SN/3767.21一2014等灌第21部 战言百事守自Loop-mediated isothermal ampHfication detection method for genetically modified co血ponentsi应foodfor export-Part 21 ! Rice 区F62014-01-13发布2014-08-01实施，.扣码至3句队. ，jr哼回回飞$啦、_1-. 忡JA臼路4网出wwwcnl1引5刷、1l!3揭4元二画:华白人民共和一曾发布菌家庭贯主茧监督棱较拴痊总SN/T 3767.21-2014 自自昌共民7人31化-T+宋任中每分部睛局杨圳
2、帧叫为二也也-FL刀井边检凯到拉傅法盯川人!方剧也叫刘调配制津U川流不天士早mu构因君灿机惆亚布共同天部发。民卡的口人实扩件归华新Em 且文井中李辑出肚本甜院胜介肌税纣究文环土芦、研黄飞士。的专员、司3.，.，.，.，.，.，飞了封及委轩时.，.，MMLzmL眼瞅眩部制址。理刷刷?LLLMZry1叫:EL协TzrEAtM中定口口品品248品品口4768口口口口C品四111占3的二J检口口6088NN20454N3口DI-6171内一口i局陈:昨MUmmmmMM2:1:叮叮tt川市出肌出用选米米米米米米米王玉王王王大大大大大刺材材材材材材水小甜油G件家单检起川喃地而344433JLULUULLL
3、LUU八KA川弘批A川八知LKh七八川八如八趴八知弘Luug照文国草境要盯分分分分分分分分分可叩于叩叩叩咔部部部部叩rr排部部吨叩叩们阳为按本由起人主T部部部部部部部部部017345h789ohbh456789JW分分意分分出分V123456789111111111122222222223部部注部部东部。白第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本广本勇国志和李I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第21部分:水稻区F6品系SN/3767.21-2014 SN/T 3767的本部分规定了系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本
4、部分适用于稻谷和大米中本方法的定性检测低限为0.5%(2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用GB/丁6682GB/19495.2 GB/T 19495.3 GB/T 19495.7 转基因产品SN/T 3767.2-2014 出口选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因水稻KF6品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内、外引物各一对(特异性目标序SN/T 3767.21-2014 列和引物碱基序列参见附录A)，特异性识别目标
5、序列上的六个独立区域，并设计一对环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加入预先混合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时组离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被悴灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与组离子结合，形成不可逆的沉淀物
6、，将锤离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镜离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:65.0 oC土0.5oC和80.0oC土0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2
7、dNTPs悔液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合鹊(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f-lL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HC1(pH值8.8)、100mmol/L硫酸债、100mmol/L 氧化押、20mmol/L硫酸镜、1%Triton X-100。6.3.5 硫酸镜溶液:50mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:钙黄绿素(Calcein)。6.3.8 引物:根据转基因水稻KF6品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1
8、和内引物2，环引物1和环引物2。外引物lCF3，5一3):CCCTGACCTAGTTGAGCAACGATAC 外引物2(B3 , 5 -3 ) : GCTCGCACCGCTCGGCTTTG 内引物1(FIP , 5 -3 ) : TCTCCAG TTGG A TTCAGCGGGCCGG AGCGGCG TTTCCCA T AG T 内引物2(BIP , 5 -3 ) : CTCTCCTCTGTGAGCATCGGTGTAGAGCCAGCAGCGGCGTTTTCC 环引物1(FLP , 5 -3 ) : CCGAGTTCACCTTTCCTCTCT A TG 环引物2(BLP，5一3): GCAAC
9、CAACCTAGGAGTAGTAGAGAA 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:SN/T 3767.21一2014采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4 .1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA洛解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进
10、行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 水稻KF6品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1水稻KF6品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/fLL反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2.5 1 外侧上游引物(F3)5mol/L 1. 0 0.2mol/L 外侧下游寻l物(B3)5mol/L 1. 0 0.2 fL mol/L 内侧上游引物(FIP)4
11、0mol/L 1. 0 1. 6 fL mol/L 内侧下游引物(BIP)40 fL mol/L 1. 0 1.6mol/L 上游环引物(FLP)10mol/L 1. 0 0.4mol/L 下游环引物BLP)10mol/L 1.0 0.4 fL mol/L clNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸筷100 mmol/L 6 mmol/L 0.5 (包括缓冲液中所含硫酸续)钙黄绿素(Calcein)2.5 mmol/L 1 0.1 mmol/L Bsl DNA聚合酶8 U/L 1 0.32 U/L DNA模板100 吨/L
12、2 8 ng/L 水补足至25.06.4.4 LAMP反应参数65.0 oc :l: 0.5 oc恒温扩增60min , 80.0 oc土0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4 .5 显色反应反应结束后，在黑色背景下立即进行颜色观察。3 SN/3767.21一20146.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管;
13、中蔽体均虽橙色，闰时各种果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管:中液体至沙1智主绿色，向转基因水稻KF8品系初筛阳性还应通过对夕阳6PCR(见附录A)o/产8 结果表述结果正常，可判断该样品检测结验对照结果正常，可判断该样品进行序列测定等相关方法进行确证8.1 检测结果为阴性表述为该捍品未栓出转基因水黯KF6品系斗8.2 检测结果为转基因水稻KF品索衍筛附吐一应按照确证实验情况进行结果判断和表述。4 SN/T 3767.21-2014 附录A(资料性附录)转基因水稻KF6品系基因序列A.1 转基因水韬KF6晶系外源基因和水韬边界序列1CCCTGACCTAGTTGAGCAACGATACGTT
14、GTTGTGGAGCGGCGTTTCCCATAGTTCCATAG 61 AGAGGAAAGGTGAACTCGGGCCCGCTGAATCCAACTGGAGAGGCCATGATCTGGTGTCCA 5 立ONlFN.SSH在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第21部分:水稻KF6品系SN/丁3767.21-2014兴中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533l湾址www.spc.口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880X1230 1/16 印张0.75字数10千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数1-1300 定价16.00元兴书号:155066.2-27475 SN/T 3767. 21 2014
