1、出检验检行SN/3767.22-2014 介Il目等温扩增(22部Al组);水平面JM脱叫u国翩翩hvA可BH队飞且可bgqLoop-mediated isother血ala盟plificationdetection method for geneticaUy modified co踊ponentsin food for export-Part 22 : Rice 区F82014-01-13发布2014-08-01实施飞。当配问-AM吨一副冲hvJ气J加耻乓GU陪同中华人民共和白雪发布家殷量监督撞验检查莲总局SN/T 3767.22-2014 自GSN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导
2、等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分
3、:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻如-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT叩门品系。本部分为SN/T3767的第22部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督
4、管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中国检验检疫科学研究皖、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人:陈颖、邓婷婷、黄文胜、吴亚君、李新实、傅凯、韩建勋、王斌、胡朗、陈文炳、李志勇。I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第22部分:水稻区F8品系SN/T 3767.22-2014 SN/T阳的本部分规定了阴阳米市转到一7R#fjKF8;系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于稻谷和大米中转:基因水韬KF8品系特异性的定性接测。本方法的定性检测低限为0.5ro(质量分致o2 规范性引用文件下列文件
5、对于本文件的应用是了必不可少的。l;是注官如期的弓I用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本(钮括所有的楼改单适用T本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格稳试验方法; GB/T 19495.2 转基因产品植测实验室技术要求GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方去l GB/T 1阳5.7转基因产品检归/抽样和制存方法、SN/T 3767.2-2014 出口食品中转基因成分环介导等摄扩增(AMP)检测方法第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T1J9495，2的规定。4 抽样与制样按照GB/T19495.
6、7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP栓w!IJ方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因水稻KF8品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内、外引物各一对(特异性目标序SN/T 3767.22-2014 列和引物碱基序列参见附录A)，特异性识别目标序列上的六个独立区域，并设计一对环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2十结合，产生副产物(
7、焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加入预先泪合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锯离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被碎灭，呈现撵色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与钮离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锚离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镜离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:65.0oC:!:0.5 oC和80.0oC
8、 :!:0.5 oC。6.2.3 离心管:0.1mL、l.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs梅液:每种核昔酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f-lL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/ L TrisHCICpH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100mmol/
9、L 氯化押、20mmol/L硫酸镜、1%币itonX-100。6.3.5 硫酸镇溶液:50mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:钙黄绿素CCalcein)。6.3.8 引物:根据转基因水稻KF8品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物l和内引物2，环引物1和环引物2。夕卡引物1CF3 , 5 -3) : GCAAATATCTGACCCTGCAGACTGG 夕卡引物2CB3 , 5 -3) : CCCTGGCGTT ACCCAACTT A 内引物l(FIP，5人3): TGAATGGCGAATGCT AGAGCAGCTTGTGCC
10、ATCAAGATGCCAGA CCTGATAGT 2 内引物2C BIP , 5 -3 ) : AACTG TTGGG AAGGGCG A TCG A TCGCCTTGCAGCACA TCC 环引物1C FLP , 5 -3 ) : CG TTTCCCGCCTTCAG TTT AA 环引物2C BLP , 5 -3 ) : CGGGCCTCTTCGCT A TT ACG SNj3767.22-2014 6.4 实验步骤6.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DN
11、A作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:一一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一一-LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SNjT3767.2-2014的规定进行。6.4.3 水稻KF8品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴
12、在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1水稻KF8品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2. 5 I 外侧上游引物CF3)5mol/L 1. 0 0.2mol/L 外侧下游引物CE3)5 /1- mol/L 1. 0 o. 2 Imol/L 内侧上游引物CFIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内侧下游引物CEIP)40 /1- mo1/L 1. 0 1. 6 /1- mol/L 上游环引物CFLP)10mol/L 1.0 0.4mol/L 下游环引物CELP)10mol/L 1.0 0.4mol/L dNTP
13、s 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续100 mmol/L 0.5 6 mmol/L (包括缓冲液中所含硫酸筷)钙黄绿素CCalcein)2.5 mmol/L 1 0.1 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/1- L 1 0.32 U/L DNA模板100 ng/1- L 2 8 ng/L 7( 补足至25.03 SN/3767.22-2014 6.4.4 LAMP反应参数65.0 c :r 0.5 C恒温扩增60mi口，80.0C :r 0.5 c 5 min使酶灭j舌，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将黑色
14、背景下立即进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验r一6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。I6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈摆色。f6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色了一叫/俨7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管宁段体均蛊撵色af:回国:各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管争搜棒至少1管呈绿色，雨时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因水稻KF8品系初筛阳性，还在通过玲排引物卫CR扛培巾归WJ进行序列测
15、定等相关方法进行确证(见附录A)。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因水稻4 断和表述。SN/T 3767.22-2014 附录A (资料性附录)转基因水韬KF8品系基因序列A.1 转基因水稻KF8品系外源基因和水稻边界序列1 GCAAATATCTGACCCTGCAGACTGGCCATCAAGATGCCAGGCCTGATAGTTTAAACTGAA 61 F1c工vF2FIP:四A肌mtTTA叫fm叮GEdBIP: AAGGTCG;)牛CG?叫ACTCC5 立ONiNN.hRH在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第22部分:水韬KF8品系SN/T 3767.22-2014 长中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三星河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址www.spc.丑et.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷;.:-印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷1/16 2014年12月第一版印数1-1300 开本880X 1230 定价16.00元亏阿书号:155066 2-27476 SN/T 3767.22-2014
