1、出验电单2 SN/3767.25-2014 晶中转基k!T温扩增(AM 第25部分;水黯c 鸣、Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified compone时sin food for export-Part 25: Rice M12 2014-01-13发布2014-08-01实施中华人民共和四发布国家藏量监督栓验桂、查总局SN/T 3767.25-2014 lJ AW 刷武境一入车任出生分责东酌哺山川广赵妇和国为专阳划分些具王洪盹民勋应用认建方刑一哗韩j!、日mh临研阳明盯构学
2、A川机科实M布业新发。农李汹曰的口省主肘。件归林国E文并士口才明白山本刊院口肌四时帆批刽瞅帧剧。的专员Ehp川刀.，.，.，.，.，1分出及委料剑婷捕，.，MML系LA巧MJ部给涉理由剧时时TLLLMZr川朵朵可叫叫叫rEZLM悟:rzr们肿眼咱哺咱山削阳附则侧叫叫乱mwm阳3口口口口nu阳崎M叫门的内可酣以散啡时机一问归旧山mmmmMM下扭圳MMmm川Mmm阳U阳UU肌肌肝川门耻刷冲帽Eh毛史米米米封封豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜Tijt的认位J草出用选米米米米开封封玉玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小甜油VG件家单士/起川喃地摊334433JA川弘弘弘弘七七七LLUUL七七LULUL
3、LuhLULUULUUS照文国草周要盯分分分分分分分分分部部部部部部部部常部部部部部部部部甜部部部明按本由起七十、王瓦T部部部部立口部部部部012345678901234567890元分意分分阳分知123456789111111111122222222223部部注部部、部。山第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本局本勇疫志检李I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第25部分:水稻M12品系SN/3767.25-2014 SN/T 3767的本部分规定了稻谷和大米中转基因水稻M12品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部
4、分适用于稻谷和大米中转基因水稻M12品系特异性的定性检测。本方法的定性检测低限为0.5%(质量分数)。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法SN/T 3767. 2-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第2部分:筛选方法3
5、防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理根据转基因水稻M12品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内、外引物各一对(特异性目标序SN/T 3767.25-2014 列和引物碱物序列参见附录A)，特异性识别目标序列上的六个独立区域，并设计一对环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核1!f酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列
6、周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNAt昆合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应榕液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加入预先混合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锚离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被碎灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与钮离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锚离玉品镜撞撞嘉品辑挑岛民踊拽辛基黄绿素恢复荧光，同时体系中的镇离子与钙黄绿素结合，进一步加光，颜色也由橙色转为绿色。光激发下散发出约510nm的荧6.2 仪器和设备6.2.1 超
7、纯水发生器。6.2.2 水游锅或加热模板:65.0 oC土06.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5VL 10 6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料6.3.1 实验用水:应符合GB/T6 6.3.2 dNTPs 溶液:每种核昔6.3.3 Bst DNA聚合酶:酶(如6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:氧化饵、20mmol/L硫酸镜、16.3.5 硫酸馍溶液:50mmol/L 6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:钙黄绿素(Calcein)。6.3.8 号|物:根据转基因水稻M12品外引物2，内引物1和内引物2，环引物l和环引物20夕
8、卡引物1(F3 , 5 -3): GGGATTTATAGGGACAATTGGCTATG 外引物2(B3，5一3):CCGGAGAACCTGCGTGCAATC 1 000L。酶):浓度8U/VL。00 mmol/L硫酸镜、100mmol/L 内引物1(FIP, 5 -3 ) : T ACCGCA TCAGGCGCTCTTCCGTGCACCAGGTCAGCAAGTCCTTC 内引物2(BIP，5 -3) : AACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCTTGCGAAACGATCCTCATCCTGTC 环引物l(FLP，5人3): GCTCACTGACTCGCTGGAGCACT A 环引物2(BL
9、P, 5 -3): GGCGCAGGGGATCAAGATC 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:2 SN/T 3767.25-2014 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一一LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源
10、基因检测;否则应重新进行DNA提取椭国际麟品旺的越视i都去姗姗3767.2-2014的规定进行。显色液?昆合进入反应液中。组分ThermolPol缓冲液外引物l(F3)外引物2(B3)内引物l(FIP)内引物2BIP) 环引物l(FIP)环引物2(BIP)dN丁Ps甜菜碱硫酸筷钙黄绿素(Calcein) Bst DNA聚合酶DNA模板水6.4.4 LAMP反应参数40 40 10 10 5 2.5 mmol/L 8 U/L 100 ng/L 2 补足至25.0品DNA溶液完全加入反应液反应体系终浓度O. 2 f1 mol/L O. 2 f1 mol/L 1.6mol/L 1. 6 f1 mol
11、/L O. 4mol/L 0.4mol/L 1.6 mmol/L 0.8 mmol/L 6 mmol/L (包括缓冲液中所含硫酸续)0.1 mmol/L 0.32 U/L 8 ng/ f1 L 65.0 oC :!:0.5 oC恒温扩增60m巾，80.0oC :!:0.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，在黑色背景下立即进行颜色观察。3 SN/T 3767.25-2014 6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6
12、.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈撞色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因水稻M12品系初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一一可对外引物PCR扩增产物进行序列测定;一可进行Southern杂交;一一其他验证方法。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为该样品未检出转基因水稻M12品系。8.2 检测结果为转基因水稻M12品系初筛阳性，应按照确证实验情况
13、进行结果判断和表述。4 SN/T 3767.25-2014 附录A(资料性附录)转基因水稻M12品系基因序列A.1 转基因水稻M12品系外源基因和水稻边界序列1 GGGATTTATAGGGACAATTGGCTATGCAGCACCAGGTCAGCAAGTCCTTCCAGTATTTTG 61 CATTTTCTGATCTCTAGTGCTCCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAA GAGCGCCTGA 121 TGCGGTATTTTCTCCTCGCATCTGTGCGGTATTTCACA CAAAGTAAACTGGATGGCTT 181 TCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCG
14、CAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAG 241 GATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGG A.2 引物碱基序列及构成F3:GGGATTTATAGGGACAATTGGCTATG B3: CCGGAGAACCTGCGTGCAATC FLP:GCTCACTGACTCGCTGGAGCACTA BLP: GGCGCAGGGGATCAAGA TC F1c F2 FIP , TACCGCATCAGGCGCTCTTCCGT GCACCAGGTCAGCAAGTCCTTC Blc B2 BIP , AACTGGATGGCTTT
15、CTTGCCGCC TTGCGAAACGATCCTCATCCTGTC 5 叮FONIiN.khh的阳、Z的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第25部分:水稻M12品系SN/T 3767.25-2014 中国标f住出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三星河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址WWw.spc.n巳t.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷3 印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷1/16 2014年12月第一版fp数1-1300 开本880X 1230 定价16.00元令c书号:155066. 2-27479 SN/T 3767.25-2014
