1、验行标准SN/3767.26-2014 c 胃口基一转介等温扩增(LAM第26部分:71韬测aWA吨BHqlC-19晶飞Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 26 : Rice 1C-19 2014-01皿13发布2014-08-01实施中华人民共和医发布自家庭竞量监督撞撞检疫总局SN/T 3767.26-2014 别高业建农家国t中胡平4、弘与三门l骂一口飞守Mm附阳烧且O斗检由亏d-VAW1 为专3
2、王-Ah且一-才共山山且明UU别iui口叫iiil方剧)江呻削承龙知不黑P构国勋M九和毒队布共的阳即发。民UUI的口人实削件归华新轧文并中李样剧本剧院且视1。击究疫陈附加刑会资金知。剖专员朝阳如婷-11.，.，1.，飞fa-f及委时VMLdL报回品!。部制涉理翩蛐聊TLLLMZr川晶晶罚叫叫叫rLLZLZL暗古何时r批中定品品品MUM胆创UMME口占2UMmnh品品hrL品114牛呻川的内It芽黄叶町tummmmImmtMmmmMmm阳山川MmmE川123弘走习米封封豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜T1qed人主丰出用选米米米米封米米到玉玉玉玉大大大大大水水水水kkkk小甜油WG件家制共缸阿通
3、筛玉玉玉玉玉玉王. -US照文国革民要。-L 分分分分分分才才才注才才才分才才才才才才女人勇刀分分分分分分-JLJt/i，?为按本由起主T部部部部部部市部部部部部部部音部部部部部部部部部部部部部部部分分意分才华L志012345678901234567890中为李V123456789111111111122222222223部部注部部、部04第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本院本侠学凤科来I SN/3767.26一-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第26部分:水稻盯C-19品系1 范围品系特异性的环介导等温扩增SN/T 3767的
4、本部分规定了(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于稻谷和大米中本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，其GB/T 6682 分析实验室用件，仅注日期的版本适用于本文本文件。AA 句:inu 9 。，巧，ahu 巧JnUT JJ 创法方选)检测方法第2部分:筛3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因水稻T1C-19品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内、外引物各一对特异性目标
5、SN/T 3767.26一2014序列和引物碱基序列参见附录A)，特异性识别目标序列上的六个独立区域，并设计一对环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸主磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色波显色原理在LAMP反应体系中加入预先泪合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锤离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被悴灭，呈现橙色。
6、当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与锚离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锤离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镜离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:65.0 oC土0.5oC和80.0oC :1: 0.5 oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100f-lL;量程100Ll000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试
7、剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f-lL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl ( pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化钢、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸镜榕液:50mmol/Lo 6.3.6 甜菜碱:5 mol/Lo 6.3.7 显色液:钙黄绿素(Calcein)。6.3
8、.8 引物:根据转基因水稻T1C-19品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2，环引物1和环引物2。外引物l(F3，5 -3): CCTGCCCGTCACCGAGATC 外引物2(B3 , 5 -3 ) : GGGGCAAAGG AACA TGCAGTG 内引物l(FIP，5一3): CACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCT ATGACCCTCGAGTTTCTCCATAA 内引物2(BIP，5-3):CCAGATCCCCTGAAl丁立ACTCGGCGTTCCCCAATCATGGAGCAACAAACC 环引物1(FLP，5-3):C
9、CCTTATCTGGGAACTACTCACAC 环引物2(BLP , 5 -3) : ACGTCCGCAA TGTGTT A TTCAC 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:SN/T 3767.26-2014 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4 .1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:一一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)0 6.4.2 内源基因检测LA
10、MP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内游、基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4 .3 水韬T1C-19品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1/LL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1水稻T1C-19品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2.5 l 外引物lCF3)5mol/L 1. 0 0
11、.2mol/L 外引物2CB3)5mol/L 1. 0 0.2mol/L 内寻|物1CFIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2CBIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 环引物lCFLP)10mol/L 1. 0 0.4mol/L 环引物2(BLP)10mol/L 1. 0 0.4 f1mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续100 mmol/L 0.5 6 mmol/L (包括缓冲液中所含硫酸续)钙黄绿素(Calcein) 2.5 mmol/L l 0.1 mmol/L Bs
12、t DNA聚合酶8 U/flL l 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L 7.)( 补足至25.06.4.4 LAMP反应参数65.0 oc士0.5oc恒混扩增60min , 80.0 oC :1: 0.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，在黑色背景下立即进行颜色观察。3 SN/3767.26一20146.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈隆色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5
13、.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管8 结果表述8.1 检栅结果为阴性，表述为该8.2 检测结果为转基因水稻lTl 附录A)。4 结果正常，可判断该样品检测结验对照结果正常，可判断该样品行序列测定等相关方法进行确证。情况进行结果判断和表述(见SN/T 3767.26-2014 附录A(资料性附录)转基因水稻T1C-19晶系基因序列A.l 转基因水稻T1C-19晶系外源基因和水稻边界序列1 GGGGCAAAGGAACATGCAGTGCCATGGTCCTGAATATTCCCCAATCATGGAGCAACAA
14、AC 61 121 181 241 301 A.2 引物碱基序列及构成F3 : GGGGCAAAGG AACA B3 ,CCTGCCCGTCACCGAG FLP:ACGTCCGCAATGTG FIP , BIP:CACA B2 CGAGTTTCTCCATAA 5 寸FONiN.hh的HZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第26部分:水稻T1C-19品系SN/丁3767.26-2014争夺中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷.)-印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元兴书号:155066 2-27480 SN/T 3767.26-2014
