1、E攘飞g SN/3767.28-2014 晶中转等温扩增(LAM第28部分:1 ;现43忐叩1飞Loop-mediaed isoher血alamplification detection method for genetically 应lodifiedco服ponentsin food for export-一2014-01-13发布Par 28:明heatB73-6-1 2014-08-01实施华人民共和国发布家庭竞量监督拉拉检痊总局SN/T 3767.28-2014 目。SN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2
2、部分:筛选方法;第3部分:玉米面-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米M()N88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第四部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部
3、分:水平吕Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻iT2A一1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第28部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国黑龙江出入境检验检
4、疫局、东北农业大学、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人:荣凤侠、程阳、徐义刚、李铁柱、胡坤、张明辉、孙方达、李志勇、高东微。I SN/3767.28-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第28部分:小麦B73-6-1品系1 范围SN/T 3767的本部分规定了扩增CLAMP)初筛检测方法。本部分适用于小麦及其初环介导等温扩增检测过程的品系特异性的环介导等温的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室用A哇nu qL 门/巧，ahu 句，aq气UT , 创法方选3 防污染措施4 抽样与制
5、样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因小麦B73-6-1品系外源基因和小麦边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异SN/T 3767.28 2014 性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特导性识别目标序列上的六个独立区域，利用st酶启动循环链置换反应，在小麦B73-6-1品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显
6、色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0oC:!:0.5 oC和80.0oC土0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.
7、5mLo 6.2.4 移液器:量程0.5L10f-lL;量程10L100L;量程100Ll000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核背酸放度10mmol/Lo 6.3.3 st DNA聚合酶(如NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8Uif1.L。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-丑Cl(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化饵、20mmol/L硫酸镇、1% Trito
8、n X-100。6.3.5 硫酸镇溶液:100 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因小麦B73-6-1品系外源基因和小麦边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物20外引物扩增片段长度:215 bp 夕卡引物1(F3 , 5 -3 ) : 5 -CTTCA T A TCTTTCAA TGG ACG-3 夕卡引物2(B3，5-3): 5一CAAAACAAGAAAAAGCCCTT -3 内引物lCFIP，5-3):5-GGACCATTTCGCAGATGTAATGACCA
9、CACCGTAATCACGACG凹3内引物2(BIP，5-3) : 5 -ACGCTTTTACCTGCT立ACCATTTCAAAATTGAAAAGATCAACTCGG但36.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4. 1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板，浓度应略高于方法检测低限。2 SN/T 3767.28-2014 6.4.1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一一LAMP反应的空白对照(以DNA洛解液代替DNA模板)
10、。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外漉基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 小麦B73-6-1品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA榕液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1小麦B73同6-1品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2.5 1 外侧上游寻|物(
11、F3)10mol/L 0.5 0.2mol/L 外侧下游引物CB3)10mol/L 0.5 0.2mol/L 内侧上游引物(FIP)40mol/L 1. 0 1. 6 f1 mol/L 内侧下游引物(BIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L dNTPs 10 mmol/L 4.0 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 5.0 1. 0 mol/L 硫酸续100 mmol/L 0.6 2.4 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L 2.0 0.64 U/L DNA模板100 ng/L 2.0 8 ng/L 7.( 补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 oC
12、:!:0.5 oC恒温扩增60mi口，80.0oC :!:0.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻渥匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。3 SN/3767.28-2014 7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判
13、断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因小麦B73-6-1品系初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一一按照SN/T1943小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法进行检测;一可对外引物PCR扩增产物进行序列测定。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因小麦B73-6-1品系表述。4 照确证实验情况进行结果判断和SN/3767.28-2014 附录A(资料性附录)转基因小麦B73啕6-1品系基因序列A.1 转基因小麦B73-6-1品系外源基因和小麦边界序列228
14、1 ATAGCAATTACTCGTAAAGCTATATCTCCATTAGTGCGCCCAAAAGGAATAAGCAC /祖2TGCT(fAAC钊TTtAJf，.ATT()产AAAUATCAACTCGG-3，5 可FONitN.khh仍FHZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第28部分:小麦B73-6-1品系SN/T 3767.282014 ;.:. 中罔标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷只印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1 1 300 定价16.00元兴书号:155066 2一27483SN/丁3767.28一2014
