1、共和母国验检标;SN/3767.29-2014 母时由基因成分环介:则方法温扩增(LAM第29部分:甜7斗晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified co酷ponentsin food for export-Part 29: Sugarbeet H7-1 2014-01-13发布2014-08-01实施中华人民共和国发布陆家庭竞量监督检验捡痊总局SN/3767.29-2014 目。SN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1
2、部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米面176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3号品系;第19部分:大豆MON
3、89788品系;第20部分:水稻Bt63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻Ll卫ICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H718t!系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第29部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和
4、国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:张舒亚、李晓虹、刘金华、李富戚、吕蓉、李想、湛鸿超、宋青、高东微、李志勇、石磊。I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第29部分:甜菜国严1品系SN/3767.29-2014 SN/T 3767的本部分规定了甜赛中转基础服H7-1品系特异性的环介导等温扩增CLAMP)初筛检测方法。本标准适用于甜菜及其制品中转基困苦苦菜H7-1品系特异性的定能检测。本方法的定性检测低限为0.5%C质量分数)0 2 规范性引用文件下列文件对于本文件
5、的应用是必不可少的i题百期前前服弃，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其建新般本(钮捂所有的静改单适题于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格午在试验方法GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求付一飞GB/T 1川5.3转基因产品检测核酸提取纯他拉丁/俨GB/T 19495.7 转基因产品检那/描棒和制样方法、 SN/T 3767.2-2014 出口食品中转基因成分环介导等溢扩增CVAMP)检测方法第2部分:筛选方法3 防污染措施/ 一/环介导等握扩增检测过程的院、污染措施应符合4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB
6、/T19495.3的规定执行。6 LAMP检Y!U方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理根据转基因甜菜H7-1品系夕i、源基因和甜菜边界序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，SN/T 3767.29-2014 特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在甜菜H7-1品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA1昆合物，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的
7、小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0oC士0.5oC和80.0oC土0.5C 0 6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL, 6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有
8、试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs榕液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/，uL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCICpH8.8)、100mmol/L硫酸镜、100mmol/L 氯化钢、20mmol/L硫酸镜、l%TritonX100。6.3.5 硫酸镜榕液:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5 mol/Lo 6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6
9、.3.8 引物:根据转基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物l和内引物2，环引物l和环引物2。外引物扩增片段长度:237 bp 夕卡引物l(F3，5人3): AACACTT AGCTTGGGACAA 夕卡引物2CB3，5 -3): TGATTGAACCCAATCTGGA 内引物1C FIP ,5 -3 ) : CCGTAATGAGAAGAGAGAAACATCATATTTCTTAATTTTTGCAGGCGA 内引物2C BIP , 5 -3 ) : TCTGGGTGGCTCTAACTATTTACATTTTCTCAAGCTTGATGGGGAT
10、环引物l(FLP，5一3):AACACAAAATGCTCATAACAGCCAC环引物2CBLP，5-3):CTGAAGGCGGGAAACGACAA 6.4 检测步骤6.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:SN/3767.29-2014 采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:一一-提取DNA时设置的提取空白对!照(以水代替样品); 一一LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基
11、因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767. 22014的规定进行。6.4.3 甜菜H7-1晶系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1f-lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液海合进入反应液中。表1甜菜H7-1品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2. 5 1 外侧上游引物(F3)10mol/L O.
12、 5 O. 2mol/L 外侧下游引物(B3)10mol/L O. 5 O. 2mol/L 内侧上游引物(FIP(F1c十F2)40mol/L 1. 0 1. 6 flmol/L 内侧下游引物(BIPCB1c十四) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 环引物1(FLP , 5 -3) 40 flmol/L O. 5 O. 8mol/L 环引物2CBLP，5-3)40mol/L O. 5 O. 8mol/L clNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 O. 8日lOl/L硫酸侯150 mmol/L 1 6 mmol/L st DNA聚合酶8 U
13、/L l 0.32 U/flL DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L 水补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 c土0.5C恒温扩增60min ,80.0 C:!:O.5 c 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。3 SN/主3767.29-20146.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳
14、性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因甜菜H7-1品系初筛阳性，还应通过对外引物PCR扩增产物的序列测定进行确证(见附录A)。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，8.2 断和表述。4 SN/T 3767.29-2014 附录A(资料性附录)转基因甜菜H7-1晶系基因序列A.1 转基因甜菜H7-1晶系外源基因和甜菜边界序列AACACTTAGCTTGGGACAAACTTCTGATCCTATTT
15、CT1立ATTTTTGCAGGCGATGGTGGCTGTTATGAGCATTTGTGTTTGATGTTTCTCTCTTCTCATACGGTTTA.TGGGACTGGGGGCTCTAACT ATTTACATGAGCCTC岳王记证再豆豆豆函马孟函lCAAT口GATCCCCATCAAGCTTGAGCTCAGGATTTAGCA!陀芒TCCAGA?T牛牛f1口T产r二、CA户户A户j飞?户.A牛?户卢TA.2 引物碱基序列及构成/二二二二川F3 : AACACTT AGCTTGGG ACAA/丁七二二二立/曰:TGATTGAACC叮:叫川才F2FIP: . CCGTAATGAGAAG4GAGAAACATA Blc 5 寸Fala-h尺的HZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第29部分:甜菜H7-1品系SN/T 3767.29-2014 令、中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室，(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷号毛印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X1230 1/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元兴书号155066 2-27484 SN/T 3767.29-2014
